腎細胞癌(RCC)是成年人最常見的十大惡性腫瘤之一，近20年來其發(fā)病率呈上升趨勢。原發(fā)性RCC的主要治療方法是根治性腎切除術(shù)。然而盡管及時手術(shù)，仍有近三分之一的患者最終會復(fù)發(fā)。因此，確定調(diào)控RCC進展的關(guān)鍵機制對RCC的復(fù)發(fā)預(yù)測和治療至關(guān)重要。

環(huán)狀RNA (circRNA)具有獨特的共價單鏈閉環(huán)結(jié)構(gòu)。高通量測序已經(jīng)確定許多circRNAs在細胞中具有關(guān)鍵的生理和病理作用。在RCC的發(fā)展過程中，某些circRNAs起著不可或缺的作用。例如，cRAPGEF5通過調(diào)節(jié)miR-27a-3p/TXNIP通路抑制RCC增殖和轉(zhuǎn)移，CircSDHC通過其對miR-127-3p的海綿效應(yīng)促進RCC進展[1]。然而，RCC的診斷和治療需要進一步解析circRNA在腎癌中的作用機制。

2022年12月，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科張家興副主任醫(yī)師在Molecular Cancer發(fā)表文章CircNTNG1 inhibits renal cell carcinoma progression via HOXA5-mediated epigenetic silencing of Slug。circNTNG1在RCC中呈現(xiàn)低表達，而過表達circNTNG1對RCC細胞侵襲性具有抑制作用。臨床上，circNTNG1表達與RCC分期、Fuhrman分級相關(guān)，是RCC患者的獨立預(yù)測因素。機制上，在RCC中，circNTNG1/ miR-19b-3p/HOXA5軸可以通過DNMT3A/DNMT3L甲基化writer調(diào)控Slug的表觀遺傳沉默，從而干擾RCC的EMT和轉(zhuǎn)移。作者的研究結(jié)果為circRNA調(diào)控RCC進展提供了證據(jù)，并為未來研究RCC的治療方案提供了幾個潛在的治療靶點。

01、circNTNG1的篩選過程及在RCC中的特性以及低表達

首先作者對5對匹配的RCC患者腫瘤及癌旁組織進行了circRNA測序。由于測序顯示更多的circRNA下調(diào)，所以作者將關(guān)注點放到差異超過2倍且下調(diào)的circRNA。隨后作者又在RCC上檢索了兩個GEO circRNA微陣列數(shù)據(jù)集。在兩個數(shù)據(jù)集中篩選出了16個表達下調(diào)的circRNA。二者取交集發(fā)現(xiàn)有3個circRNA，其中circNTNG1是下調(diào)最顯著的circRNA。檢測發(fā)現(xiàn)，circNTNG1在腫瘤樣本中顯著下調(diào)，其低表達與較差的OS和RFS相關(guān)以及臨床癥狀相關(guān)。這表明，circNTNG1在RCC中可能具有抑瘤作用。

CircNTNG1(circBase ID: hsa_ circ_0002286)來自1號染色體上的NTNG1基因，由外顯子1反向剪接而成。Sanger測序證實了RCC細胞中存在CircNTNG1。背靠背引物驗證/FISH定位/R酶耐受處理證明CircNTNG1的成環(huán)/定位胞質(zhì)/穩(wěn)定性。

02、CircNTNG1對miR-19b-3p產(chǎn)生海綿效應(yīng)

circRNA的關(guān)鍵功能之一是它們發(fā)揮miRNA海綿機制，從而調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)基因表達。作者選擇了四種算法(SVMicrO, DIANA-microT, ENCORI和miRanda)進行重疊預(yù)測，最終篩選出了hsa-miR-9-5p、hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-92b-3p。經(jīng)過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，只有miR-19b-3p能與circNTNG1相互作用。隨后，RIP發(fā)現(xiàn)，circNTNG1和miR-19b-3p都可以與Ago2結(jié)合。FISH也顯示，circNTNG1和miR-19b-3p在細胞質(zhì)中共定位。RNA pulldown實驗發(fā)現(xiàn)，circNTNG1探針組中miR-19b-3p的表達顯著下降。而過表達circ-NTNG1亦導(dǎo)致miR-19b-3p顯著下調(diào)。

miR-19b-3p在腫瘤組織中高表達，與低OS和RFS顯著相關(guān)，其主要調(diào)控功能是離子結(jié)合和核酸結(jié)合。作者應(yīng)用miR-19b-3p模擬物促進RCC細胞遷移和侵襲，而抑制劑則相反，這體現(xiàn)了miR-19b-3p的致癌能力。

03、miR-19b-3p通過抑制HOXA5的表達調(diào)控RCC的進展

在circNTNG1/miRNA/mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)中，預(yù)測出20個下調(diào)最顯著的mRNA中，只有NR3C2、PPARA、SOX6、SMARCA2、HOXA5和SATB1與核酸結(jié)合活性相關(guān)，這與miR-19b-3p的預(yù)測功能一致。應(yīng)用miR-19b-3p模擬物的RCC細胞系769P進行體外驗證后，HOXA5成為最有希望的下游靶點。雙熒光素酶報告實驗驗證，miR-19b-3p與HOXA5結(jié)合。并且，miR-19b-3p mimic/inhibitor亦能抑制/促進HOXA5的表達。HOXA5是HOXA家族中獨特的RCC抑癌基因。隨后作者發(fā)現(xiàn)，過表達HOXA5可降低RCC細胞的遷移和侵襲能力，敲低則相反，但是無論過表達還是敲低，都不改變增殖能力。體外實驗結(jié)果亦顯示，在過表達HOXA5可減少肺定植，肺轉(zhuǎn)移灶明顯減少。

04、HOXA5通過下調(diào)SNAI2 (slug)抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)激活

為了確定HOXA5調(diào)控的下游通路，作者進行了GSEA分析。通過TCGA (ccRCC)數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)，EMT通路失活在HOXA5高表達組中富集。由于EMT通路是腫瘤進展[2]的重要調(diào)節(jié)因子，作者推測HOXA5通過抑制EMT通路抑制RCC轉(zhuǎn)移。進一步探索發(fā)現(xiàn)，HOXA5與EMT驅(qū)動因子Slug的表達呈現(xiàn)負相關(guān)。這些結(jié)果表明，HOXA5作為RCC中的抑癌基因，可能通過抑制EMT驅(qū)動基因Slug發(fā)揮作用，進而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

然而，HOXA5如何抑制Slug？GO分析表示，HOXA5是一種典型的DNA結(jié)合蛋白，與轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)。因此，HOXA5可能作為轉(zhuǎn)錄抑制因子來實現(xiàn)對Slug的抑制作用。結(jié)合JASPAR數(shù)據(jù)庫和序列分析，作者發(fā)現(xiàn)Slug的啟動子區(qū)域包含一個被HOXA5識別的特定序列。此外，參考肝癌HOXA5 ChIP-seq數(shù)據(jù)集(GSE170384)，在Slug啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了幾個峰值。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計了針對Slug啟動子區(qū)域的引物，HOXA5 ChIP-qPCR實驗中該引物被顯著富集。并且，在HOXA5過表達后，隨著Slug的重新表達，蛋白質(zhì)和細胞的遷移/侵襲能力也發(fā)生了相應(yīng)的變化。這些結(jié)果證實了HOXA5與Slug的啟動子區(qū)結(jié)合并抑制其表達，從而調(diào)節(jié)EMT。

05、HOXA5招募DNMT3A，增加Slug啟動子區(qū)DNA甲基化水平

在確定HOXA5與Slug之間呈現(xiàn)負相關(guān)后，作者進一步研究HOXA5與Slug啟動子序列之間的相互作用。Slug mRNA表達與其啟動子甲基化水平呈負相關(guān)。并且，在Slug促進運動區(qū)域，有兩個CpG島靠近hoxa5結(jié)合位點。因此，作者推測HOXA5可能通過增加其啟動子區(qū)域的甲基化水平來抑制Slug的表達。為此，根據(jù)CpG島設(shè)計了3組引物。在過表達HOXA5前后對769P細胞進行MeDIP，發(fā)現(xiàn)甲基化水平在所有三個位點都有所增加，并且引物A和B檢測到更明顯的富集。在人類細胞中，有三種主要的DNA甲基化writer：DNMT3A, DNMT3B和DNMT1[3]。作者發(fā)現(xiàn)HOXA5和DNMT3A存在相互作用。此外，使用覆蓋HOXA5結(jié)合位點的引物的ChIP-qPCR顯示，HOXA5過表達后，DNMT3A向Slug啟動子區(qū)域的募集顯著增加，RCC細胞遷移/侵襲能力恢復(fù)。這些結(jié)果表明，HOXA5通過招募DNMT3A形成復(fù)合物并隨后增加Slug啟動子的甲基化水平來抑制Slug的表達。

06、circNTNG1/miR-19b-3p/HOXA5調(diào)控軸的完整性

circNTNG1/miR-19b-3p/HOXA5調(diào)節(jié)軸的成員是緊密相關(guān)的。為了進一步研究該軸的完整性，作者進行了一系列正向和反向?qū)嶒?。?yīng)用miR-19b-3p模擬物或抑制劑后，HOXA5、Slug和EMT標(biāo)記物的表達水平出現(xiàn)了相應(yīng)的變化。此外，在circNTNG1過表達后添加miR-19b-3p模擬物逆轉(zhuǎn)了HOXA5和Slug蛋白表達的變化以及RCC細胞的遷移和侵襲表型，而過表達HOXA5可逆轉(zhuǎn)這些結(jié)果。同樣，在小鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)移瘤模型中，miR-19b-3p可以消除circNTNG1過表達的腫瘤抑制作用，恢復(fù)肺腫瘤定植能力。同樣，過表達HOXA5后，miR-19b-3p的作用被抑制。綜上所述，circNTNG1/miR-19b-3p/ HOXA5軸存在于RCC中，并調(diào)節(jié)RCC的進展。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1186/s12943-022-01694-7

參考文獻：

[1]?Chen Q, et al. CircRNA cRAPGEF5 inhibits the growth and metastasis of renal cell carcinoma via the miR-27a-3p/TXNIP pathway. Cancer Lett. 2020; 469:68–77.

[2]?Ribatti D, Tamma R, Annese T. Epithelial-mesenchymal transition in Cancer: a historical overview. Transl Oncol. 2020;13(6):100773.

[3]?Jeltsch A. Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases. Chembiochem. 2002;3(4):274–93.