今天給同學(xué)們分享一篇線粒體自噬+分型+小分子藥物的生信文章“The landscape of mitophagy in sepsis reveals PHB1 as an NLRP3 inflammasome inhibitor”，這篇文章于2023年6月8日發(fā)表在Front Immunol期刊上，影響因子為8.738。

線粒體自噬是一種選擇性自噬，針對(duì)受損和潛在細(xì)胞毒性的線粒體，可以有效防止受損線粒體產(chǎn)生過(guò)多的細(xì)胞毒性產(chǎn)物，并緩解炎癥反應(yīng)。然而，線粒體自噬在膿毒癥中的潛在作用尚未得到充分探索。

1. 膿毒癥隊(duì)列中線粒體自噬標(biāo)志集的構(gòu)建

為了測(cè)試膿毒癥患者的線粒體自噬活性是否發(fā)生變化，作者首先評(píng)估了急診室（ER）或重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）樣本中與線粒體自噬相關(guān)通路的富集情況（圖1A）。作者發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，膿毒癥患者的線粒體自噬活性普遍下調(diào)，尤其是ICU患者中的線粒體自噬正調(diào)控，表明線粒體自噬在膿毒癥患者中可能起著重要作用。為了進(jìn)一步探索線粒體自噬在膿毒癥中的作用，作者通過(guò)WGCNA分析將膿毒癥樣本聚類(lèi)為15個(gè)非灰色模塊（圖1B-D）。在分析不同模塊之間的相關(guān)性、樣本的臨床特征和線粒體自噬通路得分之后，作者發(fā)現(xiàn)MEgreenyellow模塊與多個(gè)線粒體自噬通路呈高度相關(guān)（圖1C）。在進(jìn)一步關(guān)注MEgreenyellow模塊后，作者選擇了與線粒體自噬通路高度相關(guān)的926個(gè)基因，與線粒體自噬相關(guān)的基因進(jìn)行交集運(yùn)算，最終獲得了22個(gè)與膿毒癥患者中線粒體自噬相關(guān)的核心基因（圖1E，F(xiàn)）。這22個(gè)中心基因主要富集在多種線粒體生成相關(guān)模塊中（線粒體膜、線粒體組織、線粒體基質(zhì)、線粒體運(yùn)輸、中心碳代謝等）（圖1G）。

圖1 在膿毒癥隊(duì)列中確定線粒體自噬特征集

2. 根據(jù)線粒體自噬的特征集，在一組膿毒癥患者中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)線粒體自噬亞型

由于膿毒癥患者的線粒體自噬程度普遍低于健康人群，作者接下來(lái)測(cè)試了膿毒癥患者中與線粒體自噬相關(guān)基因的表達(dá)差異。作者進(jìn)一步對(duì)獲得的22個(gè)關(guān)鍵線粒體自噬相關(guān)基因在膿毒癥樣本中進(jìn)行一致性聚類(lèi)分析（圖2A），發(fā)現(xiàn)不同膿毒癥樣本中的線粒體自噬基因可以穩(wěn)定地聚類(lèi)成3個(gè)亞型（圖2B）。作者以線粒體自噬相關(guān)的中心基因富集分?jǐn)?shù)作為評(píng)估不同樣本中線粒體自噬活性的標(biāo)準(zhǔn)MA分?jǐn)?shù)。顯然，Cluster A中的中心基因富集非常豐富，而Cluster C中的MA分?jǐn)?shù)明顯下調(diào)，Cluster B則作為線粒體自噬變化的過(guò)渡亞型（圖2C，D）。通過(guò)對(duì)不同臨床特征的評(píng)估，作者發(fā)現(xiàn)ICU樣本的線粒體自噬MA分?jǐn)?shù)低于ER樣本（圖2E）。此外，MA分?jǐn)?shù)隨著SOFA（序貫器官功能衰竭評(píng)分）的增加而降低，SOFA評(píng)分用于評(píng)估臨床實(shí)踐中膿毒癥的嚴(yán)重程度（10）（圖2F）。然而，MA得分在存活和死亡患者之間無(wú)法比較（圖2G）。此外，SOFA得分越高，Cluster C的百分比也越高。Cluster A與Cluster C呈反向關(guān)系（圖2H）。同樣，Cluster A主要富集在ER樣本中，而Cluster C主要富集在ICU樣本中（圖2I）。通過(guò)評(píng)估線粒體自噬生物過(guò)程的富集情況，作者確認(rèn)Cluster A具有最高的線粒體自噬活性，而Cluster C顯示出最低的線粒體自噬活性（圖2J）。

圖2 嚴(yán)重感染隊(duì)列中的線粒體自噬聚類(lèi)

作者接下來(lái)測(cè)試A、B和C類(lèi)群中哪些分子和級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)了線粒體自噬活性（36）。在與自噬相關(guān)的分子中，ATG5和ATG9B能夠誘導(dǎo)自噬體的形成，而在泛素家族中的UBC也顯著增加在A類(lèi)群中（圖2K）。在獨(dú)立于泛素的線粒體自噬中，PRKN在A類(lèi)群中顯著上調(diào)，而AMFR和MUL1則在A類(lèi)群和B類(lèi)群中富集（圖2L）。在受體介導(dǎo)的線粒體自噬中，多種相關(guān)分子（如BNIP3、FUNDC1等）在A類(lèi)群中增加（圖2M）。此外，線粒體動(dòng)力學(xué)和應(yīng)激誘導(dǎo)相關(guān)分子在不同類(lèi)群中也發(fā)生了變化（圖2N、O）。以上結(jié)果表明，線粒體自噬功能障礙可能導(dǎo)致不同程度的膿毒癥病理狀態(tài)，并且多個(gè)分子途徑參與了膿毒癥中的線粒體自噬。

3. 線粒體自噬亞型中的免疫景觀差異

膿毒癥的發(fā)病機(jī)制涉及復(fù)雜的全身炎癥網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)和免疫功能紊亂。因此，作者進(jìn)一步探索了不同亞型之間的免疫特征差異。作者整合了多種免疫分析算法，并將所有免疫細(xì)胞分為四個(gè)來(lái)源：淋巴細(xì)胞、髓系細(xì)胞、干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞（圖3A）。淋巴細(xì)胞在A亞型中富集（圖3A），但在C亞型中顯著減少（圖3B）。不同類(lèi)型的髓系細(xì)胞分布在這3個(gè)亞型中。例如，M2巨噬細(xì)胞的豐度在A亞型中顯著增加（圖3C），這可能與抗炎反應(yīng)的增強(qiáng)有關(guān)?；|(zhì)細(xì)胞和共同淋巴祖細(xì)胞（CLP）的富集在亞型之間存在差異（圖3D、E）。在整體免疫景觀中（圖3F），從A亞型到B亞型，再到C亞型，淋巴免疫細(xì)胞的豐度逐漸減少，而髓系免疫細(xì)胞的豐度增加，從而介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)的加重。此外，與對(duì)照組相比，B亞型中不同免疫細(xì)胞比例的差異并沒(méi)有明顯改變。作者還關(guān)注了膿毒癥不同亞型中免疫檢查點(diǎn)表達(dá)的變化（圖3G）。與正常樣本相比，發(fā)現(xiàn)了一些免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因的表達(dá)水平在C亞型中發(fā)生了許多變化，例如CD274和PDCD1LG2上調(diào)，而CTLA4和TIGIT下調(diào)，這可能與體內(nèi)炎癥效應(yīng)增強(qiáng)和免疫功能障礙有關(guān)。線粒體自噬功能障礙在一定程度上反映了免疫特征的變化。

圖3 線粒體自噬亞型的免疫景觀

4. 作為與線粒體自噬相關(guān)的基因，PHB1在不同的亞型中表達(dá)差異明顯

為了從線粒體自噬中心基因中識(shí)別出與亞型相關(guān)的核心靶點(diǎn)，作者將中心基因模塊化并分為兩個(gè)模塊（圖4A），其中核心模塊主要與線粒體膜和線粒體包膜的生物過(guò)程相關(guān)（圖4B）。在這些基因中，作者發(fā)現(xiàn)PHB1位于整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的核心位置，具有最高的度值。PHB1是與線粒體自噬相關(guān)的基因，在線粒體自噬中發(fā)揮重要作用。作者進(jìn)一步研究了不同亞型和臨床特征中PHB1表達(dá)的差異。亞型A的PHB1表達(dá)高于健康樣本，而亞型C的表達(dá)低于正常樣本（圖4C，D）。此外，隨著SOFA分級(jí)的增加，PHB1的表達(dá)降低（圖4E）。與亞型A相比，亞型C顯示出高表達(dá)的經(jīng)典炎癥小體相關(guān)通路，即Nod樣受體信號(hào)通路（圖4F）。作者還關(guān)注了其他與炎癥相關(guān)的通路的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)亞型C中的炎癥反應(yīng)高度上調(diào)（圖4G）。炎癥相關(guān)途徑的變化通常伴隨著多個(gè)炎癥小體表達(dá)的變化。在三個(gè)聚類(lèi)中，多個(gè)炎癥小體分子在C聚類(lèi)中上調(diào)表達(dá)（除了NLRP1）（圖4H）。此外，核心線粒體自噬分子PHB1與多種炎癥小體分子呈負(fù)相關(guān)，特別是與NLRP3、MEFV和NLRP12（圖4I）。由于炎癥小體具有多種分子調(diào)控途徑，作者還探索了線粒體自噬聚類(lèi)中不同炎癥小體相關(guān)調(diào)控途徑的分子表達(dá)，發(fā)現(xiàn)多個(gè)調(diào)控分子存在聚類(lèi)差異（圖4J）。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，線粒體自噬功能障礙與炎癥效應(yīng)高度相關(guān)。

圖4 線粒體自噬中PHB1的鑒定

5. PHB1通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體自噬抑制NLRP3炎癥小體的激活

大量研究表明，NLRP3炎癥小體的異常激活在膿毒癥的發(fā)病和進(jìn)展中起著重要作用。NLRP3炎癥小體對(duì)病原相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）非常敏感，如ATP和線粒體DNA（mtDNA）。在感知PAMPs和/或DAMPs的過(guò)程中，NLRP3招募ASC和半胱天冬酶-1，導(dǎo)致半胱天冬酶-1的激活、成熟和分泌促炎細(xì)胞分子，如IL-1β和IL-18，從而引發(fā)火焰細(xì)胞死亡。NLRP3炎癥小體被廣泛認(rèn)為是治療膿毒癥的理想藥物靶點(diǎn)。

為了驗(yàn)證核心線粒體自噬分子PHB1對(duì)NLRP3炎癥小體的調(diào)控作用，作者在分離的巨噬細(xì)胞中敲低了PHB1（圖5A），并用兩種經(jīng)典的NLRP3炎癥小體激動(dòng)劑ATP和Nigericin刺激LPS預(yù)處理的細(xì)胞。作者發(fā)現(xiàn)，在敲低PHB1后，細(xì)胞釋放的促炎因子IL-1β和IL-18顯著增加（圖5B）。同時(shí)，作者還發(fā)現(xiàn)，在敲低PHB1后，細(xì)胞質(zhì)中的線粒體DNA（mtDNA）增加（圖5C），表明可能抑制了線粒體自噬。當(dāng)作者用自噬抑制劑3-MA處理細(xì)胞時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)敲低PHB1組和對(duì)照組細(xì)胞釋放的促炎因子IL-1β之間沒(méi)有顯著差異（圖5D）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，PHB1通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體自噬抑制了NLRP3炎癥小體的激活，這與作者的數(shù)據(jù)分析結(jié)果高度一致。

圖5 PHB1通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體自噬抑制NLRP3炎癥小體的激活

6. 小分子藥物與PHB1結(jié)合的挖掘

以上分析結(jié)果表明，PHB1在膿毒癥中發(fā)揮著重要作用。為了進(jìn)一步篩選可能靶向PHB1發(fā)揮抗炎活性的小分子藥物，作者測(cè)試了來(lái)自DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)的9,468種藥物與PHB1的親和力（圖6A）。首先，作者通過(guò)文獻(xiàn)檢索和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)確定了PHB1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（圖6B、C）。由于PHB1不屬于激酶蛋白，其活性不能直接由底物激活。因此，作者嘗試篩選出能夠通過(guò)結(jié)合其泛素化位點(diǎn)增加其蛋白質(zhì)穩(wěn)定性以進(jìn)一步調(diào)節(jié)線粒體自噬的藥物。進(jìn)一步分析顯示，泛素化位點(diǎn)主要集中在SPFH2、CC1和CC2序列中（圖6B、C），因此作者將對(duì)接區(qū)域限制在這三個(gè)序列中。經(jīng)過(guò)模擬對(duì)接，作者發(fā)現(xiàn)只有9,468種藥物中的九種與PHB1結(jié)合的最佳構(gòu)象具有≤-8的親和力。進(jìn)一步篩選顯示，9種藥物中有4種藥物的構(gòu)象與PHB1的泛素化位點(diǎn)結(jié)合親和力≤-8，它們是Bemcentinib、Tirilazad、RU82209和Phthalocyanine（圖6D、E、S1-5）。其中，Bemcentinib具有最多的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)（K202_-8.0 kcal/mol，K177_-7.7 kcal/mol，K128_-7.5 kcal/mol，K128_-7.2 kcal/mol）（圖6F、G），而其他三種藥物也對(duì)泛素化位點(diǎn)具有較高的親和力，Tirilazad（K186_-8.0 kcal/mol，K128_-7.6 kcal/mol），RU82209（K177_-8.1 kcal/mol，K177_-7.0 kcal/mol）；Phthalocyanine（K186_-8.2 kcal/mol）。此外，預(yù)測(cè)顯示Bemcentinib和Phthalocyanine分別能夠與殘基K128和K186發(fā)生氫鍵相互作用，而RU82209能夠與殘基K177發(fā)生π-陽(yáng)離子相互作用?？傊?，作者已經(jīng)確定了四種可能影響PHB1蛋白泛素化修飾并發(fā)揮抗炎活性的小分子藥物（圖7）。

圖6 PHB1小分子藥物的鑒定

圖7 PHB1介導(dǎo)的線粒體自噬在感染性休克患者中的模式圖

總結(jié)

作者最終找到了四種藥物（Bemcentinib、Tirilazad、RU82209、Phthalocyanine），它們可能與PHB1蛋白的泛素化位點(diǎn)結(jié)合，增加蛋白的穩(wěn)定性。其中，作者了解到Bemcentinib目前正在研究用于非小細(xì)胞肺癌的治療，分析結(jié)果顯示Bemcentinib能夠與PHB1的多個(gè)泛素化位點(diǎn)（K202、K128、K177）具有較高的親和力。有趣的是，Bemcentinib也是Spike糖蛋白的抑制劑，此藥物此前已被報(bào)道用于COVID-19的治療，這也表明Bemcentinib可能是一種具有潛在抗炎活性的小分子藥物，可用于膿毒癥的治療。這些藥物是否能有效作用于PHB1還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。盡管如此，作者的工作仍為臨床藥物篩選和后續(xù)藥物開(kāi)發(fā)提供了線索和一定的參考價(jià)值。在后續(xù)的研究中，作者將通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選具有抗炎活性的靶向PHB1的候選化合物。