上周我們介紹了MST技術(shù)在醫(yī)學(xué)方向免純化的案例，其實在植物相關(guān)研究中同樣存在難純化的問題而且更加復(fù)雜，具體表現(xiàn)為：

>大腸桿菌中的異源表達(dá)易形成包涵體，難純化。此外，細(xì)菌系統(tǒng)下，蛋白可能錯誤折疊或者修飾不當(dāng)導(dǎo)致表達(dá)的蛋白功能無效

>目前在真核生物系統(tǒng)中有異源表達(dá)的報道，但是諸如在昆蟲細(xì)胞體系中存在糖基化嚴(yán)重的問題

>蛋白本身不穩(wěn)定/豐度低/難純化

>植物研究中構(gòu)建的GFP融合蛋白在較多情況下純化困難

面對以上研究難點，接下來跟著小編一起來看下如何利用MST技術(shù)實現(xiàn)植物研究中的免純化親和力檢測！

案例1:植物細(xì)胞壁生物合成中糖基轉(zhuǎn)移酶的篩選

鑒定和表征細(xì)胞壁生物合成和修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs)是了解細(xì)胞壁動力學(xué)的基礎(chǔ)，然而，常規(guī)GTs活性測定方法的通量非常低，且受體通常不可用。

?

作者優(yōu)化并驗證了MST可以實現(xiàn)GTs底物的高通量篩選：GTs在煙草中表達(dá)為YFP-融合蛋白，無需從細(xì)胞裂解液中純化目標(biāo)蛋白即可測定底物結(jié)合親和力。將MST方法應(yīng)用于β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶(AtGALS1)，驗證了該技術(shù)篩選NDP-糖供體底物和受體底物的能力，該方法將為下一步的研究和工程改造選擇候選材料提供極大的便利。

<MST技術(shù)應(yīng)用>

1.?MST檢測AtGALS1與供體底物的結(jié)合

將煙草中瞬時表達(dá)YFP-AtGALS1的微粒體作為熒光信號源，加入梯度稀釋的供體底物UDP-Gal，檢測得到結(jié)合親和力為112±30 μM。大鼠唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST-YFP與UGP-Gal作為陰性對照。

2.MST檢測AtGALS1與受體底物結(jié)合

MST結(jié)果顯示，在UDP的存在的情況下，AtGALS1可以與聚合度超過3的半乳糖(Gal3)結(jié)合，與聚合度超過6的半乳糖(Gal6)受體結(jié)合親和力更高。這一結(jié)果與AtGALS1的活性實驗結(jié)果一致。在沒有UDP的情況下，AtGALS1與Gal6不結(jié)合。

由于對互作分子的大小沒有限制，MST可以用于研究GTs與底物之間的相互作用，且樣品消耗量低。在裂解液中進行互作檢測克服了植物中天然GTs含量低或外源表達(dá)系統(tǒng)中蛋白質(zhì)修飾不當(dāng)?shù)恼系K，同時不會導(dǎo)致酶活性的喪失。

案例2：植物在高溫脅迫下的應(yīng)答機制研究

研究發(fā)現(xiàn)位于葉綠體的熱激蛋白21（HSP21）能夠保護光系統(tǒng)復(fù)合體II (PSII)，使其免受熱脅迫或者熱脅迫引起的氧化脅迫，但其作用的分子機制尚不清楚。

此外，熱脅迫下擬南芥HSP21依賴于GUN5的逆向信號通路激活，并直接結(jié)合PSII的核心亞基D1和D2蛋白來穩(wěn)定光合復(fù)合體。組成性表達(dá)HSP21可以增強熱脅迫下PSII 的熱穩(wěn)定性，修復(fù)gun5 突變體的熱敏感性，表明HSP21是熱脅迫條件下維持類囊體膜系統(tǒng)完整性的關(guān)鍵伴侶蛋白。研究人員借助MST技術(shù)直接在接近天然狀態(tài)下的裂解液中檢測了HSP21蛋白與PS II核心亞基D1和D2蛋白之間的親和力。

<MST技術(shù)應(yīng)用>

植物蛋白尤其是膜蛋白較難純化或者純化后活性易受影響無法進行后續(xù)實驗，利用MST技術(shù)，可直接在植物裂解液內(nèi)進行親和力檢測，無需純化。

在本次實驗中，作者直接使用過表達(dá)35S::D1-eYFP或35S::D2-eYFP的轉(zhuǎn)基因植物組織裂解液，向其中加入梯度稀釋的純化HSP21蛋白，檢測得到HSP21與D1/D2的親和力Kd分別為0.67μM和1.32μM。

使用煙草瞬時表達(dá)或者構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物體系，熒光標(biāo)記蛋白相對容易表達(dá)。直接在葉片裂解液中進行互作親和力檢測，無需從細(xì)胞裂解液或異源表達(dá)系統(tǒng)中純化目標(biāo)蛋白，且具有正確的翻譯后修飾，快速準(zhǔn)確的完成親和力的檢測。