光片顯微鏡的實現(xiàn)

光片顯微鏡的基本光學布局與傳統(tǒng)顯微鏡有很大不同，但它相對來說更加直接。檢測路徑大致與寬場熒光顯微鏡相同：檢測物鏡收集從其焦平面射出并通過濾光片的光，然后管透鏡再將光投射到相機芯片上。由于不需要在檢測路徑中引入激發(fā)光，所以不需要二色鏡。不尋常的是照明路徑與檢測路徑正交，主要由相干光源和光學元件組成的照明路徑形成光片并通過照明透鏡將其投射到樣本上。

與復合顯微鏡會以直立或倒置等不同方式構建相同，光片顯微鏡也有多種實現(xiàn)方式。理想情況下，顯微鏡是圍繞樣本而建，提供盡可能最好的圖像質(zhì)量和必要的空間與時間分辨率，同時在實驗期間盡可能將樣本保持在理想條件下。因此，基于目標樣本的不同，光片顯微鏡之間也會出現(xiàn)很大的差別，盡管它們?nèi)匀痪哂邢嗤幕驹怼?/p>

光片的特性

對顯微鏡性能至關重要的是光片的特性，比如光片的厚度、均勻性和穿透散射組織的能力。理想情況下，如果一片光只照亮檢測物鏡的焦平面，就會得到一個非常薄的光學切面，同時該光片最好盡可能薄且能均勻穿過整個視野范圍。然而，衍射定律支配著光片的尺寸和光片的在整個視場中的厚度變化（圖2-1）。另外，照明物鏡的NA也需要仔細選擇，以生成一個能穿過整個視野且足夠薄的光片。由于衍射極限導致的光片形狀限制，通?？梢栽谛∫晥觯s60 μm）的薄光片（約1 μm）（圖2-1A）和大視場（約600 μm）的厚光片（約6 μm）（圖2-1B）之間進行選擇。

圖 2-1 光片的特性與生成（A）薄薄的光片只能在小范圍內(nèi)產(chǎn)生均勻的光照；（B）相比之下，只有較厚的光片才能獲得較大的視野；（C）光片可以由圓柱形透鏡一維聚焦激光束（靜態(tài)光片）或通過快速掃描激光束穿過視場（掃描光片）生成。

如何生成光片

從根本上講，光片顯微鏡可以區(qū)分為兩種類型（圖2-2C）：

(1) 使用靜態(tài)光片（通常由圓柱形光學元件生成）的顯微鏡；

(2) 使用快速上下掃描光束所生成光片的顯微鏡。

與圓柱形透鏡相比，掃描鏡具有更大的靈活性。通過改變掃描振幅可以調(diào)整光片的高度，通過改變?nèi)肷涔馐闹睆娇梢愿淖児馄暮穸?。此外，掃描形成的光片強度均勻，并且可以集成貝塞爾光束、結(jié)構照明、雙光子激發(fā)、共焦線檢測等特殊技術。另一方面，通過圓柱形透鏡形成光片由于不需要可移動的部件所以易于集成到光路結(jié)構中。在使用靜態(tài)光片時整個視野可以同時被照亮，從而使每條線的功率大大降低并且可以不受掃描鏡速度的限制獲得更高的速度，而僅受相機速度的限制。

圖2-2光片顯微鏡的實現(xiàn)和多透鏡裝置的優(yōu)點 光片顯微鏡是圍繞樣本搭建的，因此有許多實現(xiàn)方式：（A）一種基本的SPIM配置，一個物鏡用于照明，一個物鏡用于檢測，樣本在樣本倉中垂直放置；（B）在基本配置中添加了第二照明物鏡；（C）具有兩個垂直照明臂和低倍物鏡的超顯微鏡，成像室通常與光學元件隔離，以便在成像液中更好地固定大樣本；（D）具有第二檢測物鏡的配置可用于同時從兩側(cè)獲取圖像；（E）一種特殊的45°物鏡結(jié)構（iSPIM），用于使用光片顯微鏡觀察載玻片樣本；（F）用單側(cè)照明獲得的光片圖像數(shù)據(jù)會因折射、散射和吸收而產(chǎn)生圖像失真；（G）雙側(cè)照明（如在B、C和D中）可以通過將圖像的兩個照明效果更好的部分合并為一個來避免這種失真。

垂直與水平排布

為了實現(xiàn)兩條光路的正交光學排布，通常在水平方向上配置光片顯微鏡，同時樣本從上方懸掛在照明和檢測路徑的交叉處（如上一篇圖1-1，圖2-2A等）。垂直放置樣本的優(yōu)勢是方便旋轉(zhuǎn)樣本，能從多個角度對其進行成像。另一種選擇是在垂直方向配置光片顯微鏡，照明路徑通常在水平方向而檢測路徑通常在上方進行檢測（如圖2-2C等），這樣的光路配置使得在使用掃描（虛擬）光片配置時可以更方便地校準調(diào)試光路。在垂直方向配置下，樣本可以水平放置在兩條光路的交叉處，雖然這樣的方式不適合旋轉(zhuǎn)樣本，但是在其他方面的優(yōu)勢更明顯。首先是水平放置樣本時可以免去重力對樣本的拉伸變形，其次由于垂直配置下對樣本進行的位移都是沿軸向且均一的，可以防止由于在旋轉(zhuǎn)樣本時施加在樣本上的扭矩而產(chǎn)生的形變，這樣在后期進行數(shù)據(jù)拼合時更不容易出現(xiàn)錯位偏差和信號損失等情況。進一步說，除去樣本檢測過程中可能出現(xiàn)的變形的影響，水平配置光路懸掛旋轉(zhuǎn)樣本的方式由于在后期進行數(shù)據(jù)拼合時也是從各個方向進行拼合，使得最后樣本結(jié)果的分辨率不均一，從而導致整體分辨率大打折扣。

圍繞樣本搭建顯微鏡

與其他技術相比，光片顯微鏡可以更快、更有效地對固定的、透明的樣本進行成像，并且光片顯微鏡在活體樣本成像方面也具有先天的優(yōu)勢：大大降低的光毒性，結(jié)合快速采集和靈活的樣本定位，是對細胞群、組織樣本或整個動物快速發(fā)育過程的理想成像工具。為了給這些特定的成像任務提供最佳的環(huán)境條件，一些光片顯微鏡配備可盛放成像液的成像倉和水浸的照明和檢測物鏡（圖2-2A）。結(jié)合水性的樣本，可以實現(xiàn)折射率匹配的光路?？墒⒎懦上褚旱某上駛}也為成像環(huán)境的控制及成像時的養(yǎng)分或藥物供給提供方便。

樣本的一些不利光學特性會對光產(chǎn)生吸收、散射和折射，從而限制光片的穿透深度使其變寬并改變位置（圖2-2F）。這樣采集到的圖像可能出現(xiàn)模糊、不聚焦或有明暗條紋等現(xiàn)象。在這種情況下，額外的照明路徑（三透鏡配置）可以提高圖像質(zhì)量（圖2-2B）。其光學結(jié)構通常與第一條照明路徑相同，并通過額外的照明物鏡從另一側(cè)照亮樣本。由兩條照明路徑產(chǎn)生的光片照亮同一平面，即檢測物鏡的焦平面。兩條照明路徑通?？梢越惶鎲为毚蜷_，然后可以拼合來自兩個照明側(cè)的圖像中照明良好的部分，從而得到質(zhì)量均勻的最終圖像（圖2-2G）。雙側(cè)照明可以改善固定且透明標本的整體熒光激發(fā)。對于此類樣品，選擇的檢測路徑大多是垂直的（圖2-2C）。

物鏡

對于照明和檢測物鏡的選擇是決定光片顯微鏡光學性能的關鍵。一般來說，在使用盛放成像液的成像倉時，空氣物鏡由于其使用上的廣泛性，通常是首選。但想要配置高放大率的檢測物鏡通常伴隨著高NA和低工作距離，這就導致必須配置介質(zhì)鏡。但是，通常情況下，照明和檢測路徑的正交方向限制了物鏡的選擇。高NA的探測物鏡通常太大，無法與另一個正交放置的介質(zhì)鏡組合。因此，在大多數(shù)情況下，空氣物鏡是更好的選擇。幸運的是，在照明路徑不需要高NA物鏡，一個簡單的10×/0.3透鏡就足以產(chǎn)生厚度只有幾微米的光片。

References:

Engelbrecht,et al.,Optics Letters,2006

Huisken,et al.,Science,2004

Keller,et al.,science,2008