miRNA也有快速入門方法？教程拿去！
長久以來，我一直想寫一篇關(guān)于miRNA的文章。在一年半前，我也與大部分醫(yī)學(xué)科研工作者一樣，在多個學(xué)術(shù)場合聽到大咖小咖對于miRNA已經(jīng)過時的論述，聽得多了，內(nèi)心深處難免產(chǎn)生微妙的抵觸情緒。
而在我回到解螺旋開始系統(tǒng)梳理醫(yī)學(xué)科研的整體方法論之后，經(jīng)過多維度研究比較，我驀然發(fā)現(xiàn)，其實miRNA才是當(dāng)之無愧的新手之友、從SCI灌水到跨越五分檔次拿國自然基金無往而不利的科研利器。
今天，我就來談一談選擇miRNA作為研究分子類型的戰(zhàn)術(shù)理由：
1、單個變量代入五恒量，構(gòu)成了最簡單的疾病、表型加上分子的三要素課題。變量的分子類型很多，蛋白是經(jīng)典，非編碼RNA是當(dāng)紅趨勢。非編碼RNA中l(wèi)ncRNA、circRNA更有吸睛效應(yīng)，為何miRNA還有獨特優(yōu)勢？
1） miRNA是非編碼RNA，在做“表達(dá)差異”的環(huán)節(jié)不需要進行蛋白水平的檢測，不用買抗體做Western，僅qPCR檢測RNA水平即可，簡化了工作量。
2） 在執(zhí)行“一正一反”的Gain / Loss of function過程中，miRNA的過表達(dá)和沉默都只需要訂購短片段合成RNA，價格低廉且到貨周期快。同時對于大部分細(xì)胞而言，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法可實現(xiàn)高效導(dǎo)入miRNA mimics或inhibitor到靶細(xì)胞，實驗操作簡單，易于重復(fù)。
由此可見，在低分灌水階段（單變量研究，不做機制），miRNA的成文效率比做蛋白和lncRNA / circRNA高。
2、進入到二元變量組合，其中最基本的套路是用通路解釋機制，分子+通路的間接調(diào)控機制是最基本的四要素課題（疾病、表型、分子、機制）。
間接調(diào)控關(guān)系的口訣是“你動我也動”，即過表達(dá)或者沉默主變量，看下游因變量的隨之變化。當(dāng)你進行下游探索的時候，任何分子類型都執(zhí)行一樣的流程，但是因為miRNA過表達(dá)和沉默方便，miRNA的研究依然有一定便利之處。
3、二元變量更好的模式是建立直接調(diào)控關(guān)系，也就是“知其然知其所以然”——有明確的作用靶點和調(diào)控細(xì)節(jié)。在所有的直接調(diào)控模式中，miRNA作用于靶基因的3’-UTR引起下游靶基因表達(dá)沉默是所有直接作用機制中最簡單的套路，沒有之一。在實驗的操作性、論證的簡約度上，設(shè)計miRNA二元直接機制優(yōu)勢非常顯著：
1） 絕大部分直接機制的研究，都需要至少2個關(guān)鍵的實驗相互佐證，比如轉(zhuǎn)錄因子研究有ChIP，EMSA和Luciferase Assay，蛋白-蛋白相互作用有co-IP和Pulldown實驗等。
而miRNA結(jié)合靶基因的驗證只有一個經(jīng)典實驗——熒光素酶報告基因?qū)嶒灒↙uciferase Assay），這個實驗本身就是直接作用機制研究里最容易開展的實驗，也沒有之一，就是最容易做的。
2） 在明確主變量、尋找相互作用的靶基因過程中，都需要走數(shù)據(jù)庫預(yù)測或者實驗篩選的流程，RNA和蛋白相互作用或者蛋白與蛋白相互作用預(yù)測的準(zhǔn)確度不能說特別高，所以很多研究者會直接進行實驗篩選，放棄預(yù)測環(huán)節(jié)。
而miRNA的靶基因預(yù)測可以說是其中準(zhǔn)確率最高的作用形式，只需要在幾個數(shù)據(jù)庫中輸入miRNA名稱，即可輸出預(yù)測靶基因結(jié)果，將多個數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果取交集，再結(jié)合細(xì)胞株中過表達(dá)miRNA之后，這些靶基因是否具有下調(diào)趨勢的結(jié)果，即可鎖定一組直接作用分子，Luciferase Assay驗證成功，即大功告成。
3） 在機制的Rescue驗證環(huán)節(jié)，miRNA模式單一。經(jīng)典作用是負(fù)調(diào)節(jié)下游靶基因，所以口訣是“反正正，反反反”，即上下游同時過表達(dá)或者沉默。
考慮到miRNA無論過表達(dá)還是沉默都是合成短片段，所以可以根據(jù)下游基因的操作便利度選擇上游的策略。如果下游基因已經(jīng)有過表達(dá)克隆，可以用反正正手段，如果下游基因沒有現(xiàn)成的表達(dá)工具，就去合成siRNA進行沉默，用反反反同樣可以快速拿到結(jié)果。
4、超越了二元變量直接調(diào)控，還有更深入的機制模式，比如三元變量結(jié)構(gòu)——miRNA上游再提出調(diào)控分子，解答驅(qū)動因素的問題。miRNA的轉(zhuǎn)錄同樣需要轉(zhuǎn)錄因子，通過常見的轉(zhuǎn)錄因子機制模式我們可以建立更加復(fù)雜的信號軸關(guān)系。miRNA的啟動子也能被甲基化調(diào)控，轉(zhuǎn)錄出來后也受到剪切過程的調(diào)節(jié)，能夠講的故事不比其他分子類型遜色多少。
5、除了三元變量套路把機制推向更復(fù)雜的邏輯鏈條，還有一條路也適合miRNA往高分雜志走，那就是外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊。外泌體+miRNA的組合是給miRNA帶來全新活力的研究套路，進入到多細(xì)胞交互的科研境界，已經(jīng)站在了五分以上的起點上，征服國自然基金已不在話下。這種高階套路，我們在套路課的第3期就進行深入講解，上半學(xué)年可學(xué)到，打好基礎(chǔ)，不要落下學(xué)習(xí)進度。
我是酸菜，我為miRNA代言！miRNA研究有2個難點，一個是Luciferase Assay，靠你們自己突破，另一個是如何預(yù)測miRNA靶基因或者已知基因反向推測調(diào)控的miRNA，需要用到一些數(shù)據(jù)庫，這些數(shù)據(jù)庫雖然操作簡單，但總有學(xué)員感覺難以突破。
學(xué)員的需求就是老師的價值，現(xiàn)在miRNA靶基因預(yù)測出了【單元課】，從此世間不再有難做的miRNA靶基因機制。請各位學(xué)員在課程系統(tǒng)的選修課之單元課部分找到精美的PDF圖文教程。Enjoy~
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