神經(jīng)組織的細(xì)胞類型大體分為兩類：神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)元細(xì)胞是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包括分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，以及分布在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的施萬細(xì)胞和位于脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)的衛(wèi)星細(xì)胞等。

神經(jīng)組織的研究在很大程度上依賴于對(duì)其潛在細(xì)胞多樣性的了解。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步使得細(xì)胞分類學(xué)得到了快速發(fā)展，也使得在研究神經(jīng)組織細(xì)胞類型時(shí)需考慮更復(fù)雜的分子多樣性。因此，如何實(shí)現(xiàn)將目的基因?qū)胩囟ǖ纳窠?jīng)組織細(xì)胞以及在特點(diǎn)神經(jīng)組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)成了關(guān)鍵。

本期小編將從血清型選擇、組織特異性啟動(dòng)子、AAV注射方式三個(gè)方面詳細(xì)介紹一下利用AAV載體實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞特異性基因調(diào)控的策略。

血清型選擇

目前已發(fā)現(xiàn)AAV有12種血清型、100多種變體，其區(qū)別主要在于Cap基因（編碼衣殼蛋白）的不同。不同的血清型對(duì)組織或器官有著不同的親和性，從而導(dǎo)致對(duì)不同的組織和細(xì)胞感染效率不同。

通過對(duì)AAV2 RC質(zhì)粒進(jìn)行改造，獲得不同血清型的RC質(zhì)粒。在包裝病毒時(shí)，將RC質(zhì)粒、腺病毒輔助質(zhì)粒以及含有目的基因的AAV表達(dá)質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，獲得不同血清型的重組AAV病毒顆粒（rAAV），如圖1所示。

圖1. AAV病毒載體的包裝示意圖

漢恒生物可以提供多種適用于神經(jīng)組織領(lǐng)域的AAV血清型（圖2），可以根據(jù)要感染的組織細(xì)胞及具體實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇，比如AAV-Retro血清型可以用于逆行示蹤，AAV-BBB血清型可以通過尾靜脈注射跨越血腦屏障感染全腦。不同血清型AAV有不同的特點(diǎn)，漢恒生物也在不斷開發(fā)新的特異性血清型，同時(shí)歡迎有需要的老師前來咨詢。

圖2. 神經(jīng)組織AAV血清型

如圖3是使用腦血管內(nèi)皮特異性血清型AAV-BR1血清型靜脈注射感染小鼠是4周后使用小動(dòng)物活體成像檢測(cè)各組織luc的表達(dá)情況。BR1血清型是一種新型改造的AAV血清型，對(duì)腦部?jī)?nèi)皮細(xì)胞具有專一的靶向性，采用尾靜脈注射方式，不僅操作簡(jiǎn)單，而且可以獲得比較高的特異性感染目標(biāo)組織。

圖3. AAV-BR1血清型靜脈注射感染小鼠

二、組織（細(xì)胞）特異性啟動(dòng)子

特異性血清型AAV可以實(shí)現(xiàn)組織或細(xì)胞特異性感染，然而利用特異性血清型靶向的范圍仍然較寬，且特異性血清型種類較少，如果要在某種特定神經(jīng)元細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控，僅使用不同的特異性血清型的選擇是難以實(shí)現(xiàn)的，而不同組織特異性啟動(dòng)子就比較豐富，并且很多神經(jīng)元細(xì)胞都有特異性啟動(dòng)子可供應(yīng)用。因此，除了使用特異性血清型外，還可以利用特異性啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)目的基因特異性表達(dá)的目的。

如圖4所列是漢恒生物提供的用于神經(jīng)元特異性表達(dá)調(diào)控的啟動(dòng)子，并有試用裝可供試用，歡迎咨詢?cè)囉谩?br/>

圖4. 神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子

神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子（hSyn）

啟動(dòng)子是人 SYN1 基因的啟動(dòng)子， SYN1 基因表達(dá)產(chǎn)生Synapsin I 蛋白，是特異表達(dá)在神經(jīng)元內(nèi)的蛋白，因此一般選擇 hSyn 啟動(dòng)子作為神經(jīng)元的特異性啟動(dòng)子。如圖5所示，是漢恒生物客戶發(fā)表在《Nature Communications》雜志上題為“TRPV1 SUMOylation regulates nociceptive signaling in models of inflammatory pain”的文章，通過背根神經(jīng)節(jié)注射hSyn啟動(dòng)一系列目的基因的AAV病毒，實(shí)現(xiàn)基因在神經(jīng)元特異性表達(dá)。

圖5. hSyn特異性啟動(dòng)子的AAV載體注射小鼠背根神經(jīng)節(jié)

Mecp2基因的啟動(dòng)子

是甲基CpG 結(jié)合蛋白2（Mecp2）啟動(dòng)子，是一種短的神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子。如圖6所示，發(fā)表在《Neurobiology of Disease》雜志上題為“A codon-optimized Mecp2 transgene corrects breathing deficits and improves survival in a mouse model of Rett syndrome”的文章，AAV9-pME-GFP病毒載體尾靜脈注射小鼠，Mecp2啟動(dòng)子優(yōu)先驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因在神經(jīng)元組織中的表達(dá)。

圖6. Mecp2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因在神經(jīng)元中表達(dá)

早期神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子TUBA1A?

(Tα1)是微管蛋白的啟動(dòng)子，TUBA1A基因在小鼠胚胎13.5天的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）和外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中特異性表達(dá)，因此一般用TUBA1A啟動(dòng)子作為早期神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子。如圖7所示，是發(fā)表在《eNeuro》雜志上題為“Loss of Ikbkap Causes Slow, Progressive Retinal Degeneration in a Mouse Model of Familial Dysautonomia”的文章，利用TUBA1a-Cre小鼠與Ikbkap-floxed小鼠雜交獲得了Ikbkap基因條件性敲除小鼠。

圖7. Ikbkap基因敲除小鼠中cre主要是在有絲分裂后神經(jīng)元

興奮神經(jīng)元啟動(dòng)子（c-fos）

是一種活性依賴基因c-fos的啟動(dòng)子，可作為興奮神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子。如圖8所示，是發(fā)表在《Nature》雜志上題為“Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall”的文章，使用AAV9-TRE-ChR2-EYFP病毒注射c-fos-tTA小鼠，來監(jiān)控ChR2–EYFP在小鼠海馬DG區(qū)表達(dá)情況。

圖8. 小鼠海馬DG區(qū)細(xì)胞中ChR2–EYFP的選擇性標(biāo)記

前腦谷氨酸能神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子（CaMKII）

是由 Ca2+/ 調(diào)鈣蛋白復(fù)合物調(diào)節(jié)的絲氨酸蘇氨酸特異蛋白激酶。 CaMKIIa 是組成 CaMKII 的主要亞基，在前腦中， CaMKIIa 特異地表達(dá)在興奮性神經(jīng)元（即谷氨酸能神經(jīng)元）中，因此 CaMKIIa 啟動(dòng)子能作為興奮性神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子。如圖9所示，是發(fā)表在《CELL》雜志上的題為“Moderate UV Exposure Enhances Learning and Memory by Promoting a Novel Glutamate Biosynthetic Pathway in the Brain“的文章，攜帶CamKIIα特異性啟動(dòng)子的AAV9血清型腦立體定位注射小鼠海馬達(dá)到基因特異性表達(dá)效果。

圖9. 攜帶CamKIIα特異性啟動(dòng)子的AAV9腦立體定位注射小鼠海馬

GABA能神經(jīng)元/中間神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子（hVGAT）

是VGAT基因的啟動(dòng)子，由Slc32a1基因編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)體，其作用是將GABA神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)入突觸囊泡中。因此，該啟動(dòng)子可以作為GABA能神經(jīng)元的特異性啟動(dòng)子。如圖10所示，是發(fā)表在《Nature Neuroscience》雜志上題為“Circuit specificity in the inhibitory architecture of the VTA regulates cocaine-induced behavior”的文章，通過將AAV-DIO-ChR2-YFP病毒注射VGAT-IRES-Cre小鼠，實(shí)現(xiàn)了VGAT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cre依賴的ChR2的特異性表達(dá)。

圖10. ChR2在小鼠多巴胺神經(jīng)元中特異性表達(dá)

多巴胺神經(jīng)元特異性表達(dá)啟動(dòng)子（TH）

是酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)基因的啟動(dòng)子，常常用來作為CNS中的兒茶酚胺能神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子。如圖11所示，是發(fā)表在《Cell》雜志上題為“Dopamine Neuron-Specific Optogenetic Stimulation in Rhesus Macaques”的文章，通過將THp-Cre 病毒和pAAV5-DIO-Ef1a-ChR2(h134)-EYFP病毒注射到猴子多巴胺神經(jīng)元，實(shí)現(xiàn)了TH啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cre依賴的ChR2的特異性表達(dá)。

圖11. ChR2在多巴胺神經(jīng)元中特異性表

三、AAV注射方式

在神經(jīng)研究中，我們常?？梢圆捎媚X立體定位注射、腦室注射、脊髓內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、尾靜脈注射等不同的方式。尾靜脈注射感染范圍較廣，可結(jié)合漢恒生物的跨血腦屏障血清型達(dá)到感染大腦的目的。腦立體定位注射可感染到特定的腦區(qū)，脊髓內(nèi)注射可感染脊髓內(nèi)特定位點(diǎn)。

圖12. 不同注射方式

腦立體定位是神經(jīng)研究中最常用的一種注射方式，如圖9中，客戶通過腦立體定位注射方式將pAAV-mCamKIIα-hChR2(H134R)-EGFP載體，利用AAV9血清型結(jié)合特異性啟動(dòng)子CamKIIα，注射到小鼠海馬區(qū)實(shí)現(xiàn)局部感染的目的（使用方法：AAV9腦立體定位注射海馬， 注射體積0.5ul/側(cè)，病毒滴度1.33×1012 vg/mL）。

如圖13所展示的，是漢恒生物客戶發(fā)表在《Cell Research》雜志上的題為“METTL3-mediated N6-methyladenosine mRNA modification enhances long-term memory consolidation”的一篇文章，作者通過AAV2/DJ血清型病毒，腦立體定位注射背側(cè)海馬實(shí)現(xiàn)局部特異性感染的目的（使用方法：AAV2/DJ腦立體定位注射背側(cè)海馬，位置（AP = ?1.9 mm，ML =±1.2mm，DV =-1.3mm）, 注射速度0.1ul/min，病毒滴度1.0–1.2 × 1012 PFU/ml）。

圖13.腦定位注射AAV2/DJ-METTL3介導(dǎo)m6A修飾調(diào)節(jié)長(zhǎng)期記憶模型

而圖5中，客戶通過背根神經(jīng)節(jié)原位注射結(jié)合hSyn啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)組織特異性表達(dá)目的基因（使用方法：背根神經(jīng)節(jié)注射，注射滴度1.0 × 1012vg/ml以上，注射體積2ul，以 0.2μl/min的速率單側(cè)注入背神經(jīng)節(jié)）。此外，還可采用Cre依賴性基因開關(guān)（Cre-loxp系統(tǒng)），如用特異性啟動(dòng)子含cre酶的AAV不對(duì)載體注射Loxp小鼠實(shí)現(xiàn)特異性基因調(diào)控的目的，后續(xù)我們會(huì)給大家?guī)砀嚓P(guān)于Cre-loxp系統(tǒng)的干貨分享，敬請(qǐng)關(guān)注。

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