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導讀：本文主要內(nèi)容為常用的酵母菌表達體系，酵母菌表達的優(yōu)勢，常用的畢赤酵母菌菌株等。

一、常用的表達體系有哪些？

隨著基因工程技術的快速發(fā)展，對于重組蛋白的外源表達的需求也隨之水漲船高。盡管科研人員在尋找表達載體方面做出了諸多努力，但是目前主流的表達體系仍然是由大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞以及動物細胞等構成。

其中大腸桿菌屬于原核表達體系，其余的屬于真核表達體系。

大腸桿菌體系的優(yōu)勢在于其結構簡單，操作方便，外源蛋白表達量高，大規(guī)模生產(chǎn)成本較低；

其缺點也同樣明顯那就是沒有糖基化修飾能力，且胞內(nèi)易形成包涵體。

其主要原因是糖基化修飾發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，大腸桿菌是原核生物沒有細胞器自然沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，所以表達的外源蛋白沒有糖基化的修飾。

而包涵體形成的主要原因有以下幾點：

1. 1.?????表達量過高,研究發(fā)現(xiàn)在低表達時很少形成包涵體,表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快,以至于沒有足夠的時間進行折疊,二硫鍵不能正確配對，過多蛋白間的非特異性結合,蛋白質(zhì)無法達到足夠的溶解度等。

2. 2.?????重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白,真核糖蛋白無法糖基化使中間體溶解度下降,導致不溶解包涵體形成。

3. 3.?????重組蛋白分泌序列的存在阻礙折疊,導致錯誤折疊分子的產(chǎn)生。

4. 4.?????重組蛋白的氨基酸組成,一般來說含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。

5. 5.?????其他原因

酵母體系的優(yōu)點主要是兼具原核細胞良好的可操作性和真核系統(tǒng)的后加工能力，但存在產(chǎn)量低及過度糖基化等問題。

昆蟲細胞的優(yōu)點主要是具有高等真核生物表達系統(tǒng)的優(yōu)點，產(chǎn)物的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白質(zhì)相似，表達水平較高，但糖基化程度較低,形式單一。

哺乳動物細胞系統(tǒng)的有點主要是產(chǎn)物的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白質(zhì)最接近，糖基化等后加工最準確,但表達水平較低。

由于不同的表達系統(tǒng)在表達量、蛋白表達周期、蛋白折疊和加工能力、蛋白翻譯后修飾如糖基化修飾和經(jīng)濟成本等方面存在差異，因此需要根據(jù)不同的重組蛋白特點以及不同應用目的來選擇合適的表達系統(tǒng)。

耀海生物深耕大腸桿菌體系多年在大腸桿菌和畢赤酵母菌表達體系的運用方面均有豐富的經(jīng)驗，曾多次幫助友商及客戶成功解決多次項目困境并完成技術優(yōu)化。如有技術升級以及實際操作問題需求，歡迎隨時咨詢。

二、什么是酵母表達體系？

畢赤酵母表達體系是目前已知酵母體系中使用表現(xiàn)最好的且被廣泛運用。畢赤酵母菌表達體系不僅具有高穩(wěn)定、高表達、高分泌的特點，而且其宿主甲醇酵母一巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)具有高密度生長的特性。甲醇酵母是可利用甲醇作為單一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、PichiaPastoris三種。其中P.Pastoris作為基因表達系統(tǒng)使用得最多、最廣泛，己被認為是最具有發(fā)展前景的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的工具之一。

畢赤酵母菌表達體系的分泌產(chǎn)物發(fā)酵密度較高、產(chǎn)物分泌效率高且能進行糖基化表達，利用強效可調(diào)控啟動子A0X1，已高效表達了多種外源基因，證實該系統(tǒng)為高效、實用、簡便，以提高表達量并保持產(chǎn)物生物學活性為突出特征的外源基因表達系統(tǒng)，而且非常適宜擴大為工業(yè)規(guī)模。

耀海生物已經(jīng)成功設計并完成了多次畢赤酵母菌的發(fā)酵項目，對于畢赤酵母菌的大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵和獲取外源分泌物有獨到經(jīng)驗，并且已將相關經(jīng)驗整理成冊，如有需要歡迎隨時咨詢。

三、畢赤酵母菌的優(yōu)勢是什么？

除了酵母菌表達系統(tǒng)共有的優(yōu)勢之外，畢赤酵母菌還具有其自身獨特的特點。

(1)含有AOX啟動子。這是目前啟動能力最強，調(diào)控機理最嚴格的啟動子之一，用甲醇可嚴格地調(diào)控外源基因的表達；

(2)表達量高，既可以胞內(nèi)表達，又可以分泌表達。絕大多數(shù)外源基因比在原核細胞、釀酒酵母、真核細胞中表達量高。一般畢赤酵母中外源基因都帶有分泌信號肽，使外源目的蛋白分泌到培養(yǎng)液中，方便純化；

(3)發(fā)酵工藝成熟，適合高密度發(fā)酵。己經(jīng)有大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)的發(fā)酵工藝，且細胞干重達150g/L以上，表達重組蛋白時，已成功放大到80，000升；

(4)使用基礎鹽培養(yǎng)基。畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基十分廉價，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無機鹽，培養(yǎng)基中不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品分離純化；而釀酒酵母所用誘導物一般為價格較高的半乳糖；

(5)遺傳性狀穩(wěn)定。一般外源基因整合到巴斯德畢赤酵母染色體上，隨著染色體的復制而復制，不易丟失；而且遺傳背景清楚，便于遺傳操作。

(6)作為真核表達系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結構，具有糖基化、脂肪?；?、蛋白磷酸化等翻譯后修飾的功能。

四、納米抗體在新冠病毒的納米抗體中和療法中的優(yōu)勢應用

隨著新冠病毒的持續(xù)流行和不斷變種，對于新冠病毒的治療措施的研究也越來越多，但主要依靠的還是疫苗和納米抗體中和療法。

納米抗體中和療法主要依靠的是納米抗體，納米抗體作為目前已知能與抗原結合的最小片段，分子量小且穩(wěn)定，在傳染病的治療中可以通過呼吸道給藥為疾病的治療帶來極大的方便。使用納米抗體作為中和抗體用來治療新冠病毒引發(fā)的新冠肺炎是目前非常具有前景的治療手段。畢赤酵母作為異源蛋白表達常用宿主，常用于生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白。

根據(jù)《新型冠狀病毒中和毒性納米抗體在畢赤酵母的高效分泌表達》，研究人員在大腸桿菌和畢赤酵母中同時表達二價納米抗體，結果發(fā)現(xiàn)在畢赤酵母中表達的納米抗體比在大腸桿菌中表達的納米抗體具有更高的中和活性，這主要依賴的是畢赤酵母更有利于二硫鍵的形成，從而導致的納米抗體活性更高。

耀海生物在利用畢赤酵母菌進行納米抗體的高效表達方面具有豐富的實際操作經(jīng)驗，成功幫助客戶進行雙價抗體（免疫球蛋白重鏈）的畢赤酵母菌的高效表達其主要作用靶點是抗新冠重鏈可變區(qū)抗體。耀海生物致力于打造CRO/CDMO/MAH全方位納米抗體服務，歡迎隨時咨詢。

五、畢赤酵母菌使用中存在的問題有哪些？

在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中畢赤酵母菌常見的問題主要是表達量不高以及表達失敗的情況。

1.產(chǎn)物降解：畢赤酵母表達系統(tǒng)常見的講解原因是在表達蛋白的情況下，可能被自身所分泌的蛋白酶降解。隨著發(fā)酵密度的不斷增高，所分泌的蛋白酶也顯著增高，所表達的外源蛋白也會相應的被降解。

2.部分外源表達分泌不能：畢赤酵母表達系統(tǒng)可能由于自身轉錄機制等原因導致mRNA被切斷，導致相應的外源蛋白分泌能力不足。

３.甲醇的使用帶來的問題：甲醇的存放危險和使用危險。

４. 發(fā)酵周期相對較長:發(fā)酵雖然能達到非常高的菌體密度，但是發(fā)酵周期一般相對原核細胞明顯較長，容易被污染，且長時間的發(fā)酵也不利于外源蛋白的累積。

５.糖基化表達：畢赤酵母菌的糖基化表達的方式是高甘露糖型，與哺乳動物不同。

六、畢赤酵母表達系統(tǒng)的載體、菌株和轉化機制

目前主要使用的菌株均來自于原始的Y-11430菌，并以此分化出多種不同基因型的菌株，如野生型、營養(yǎng)缺陷和蛋白酶缺陷。????????????????

常用的畢赤酵母宿主菌基因型和表型如下圖所示，其中GS115，KM71和SMD1168含有HIS4基因突變而不能合成組氨酸，部分表達載體中含有HIS4基因作為篩選標記，轉化子可以在組氨酸缺陷型培養(yǎng)基中生長。另外GS115，X33，和SMD系列菌株含有野生型的A0X1基因，高達85%的甲醇利用率是由該基因完成的，轉化子通常產(chǎn)生Mut+甲醇利用表型；而KM71和KM71H的A0X1由于基因突變，不能正常的代謝甲醇，甲醇氧化酶A0X2開始負責代謝甲醇，但是這個酶的啟動子非常弱，該酶A0X2的表達量較低，甲醇利用速度較慢，轉化子通常產(chǎn)生Muts表型。Mut+甲醇利用表型的轉化子可以快速代謝甲醇，因此在甲醇培養(yǎng)基中可以快速生長，誘導表達時需要消耗大量甲醇，而Muts表型轉化子代謝甲醇能力很弱，誘導表達時需要的甲醇量很少。因此他們各有缺點，盡管多數(shù)人傾向于使用Muts菌株，但是有時候Muts菌株也可能獲得更髙的表達水平。SMD系列菌株是胞外蛋白水解酶缺陷型菌株，在使用非復合培養(yǎng)基時通常可以降低分泌蛋白產(chǎn)物的降解。

參考文獻：

[1]段燁紅.新型冠狀病毒中和毒性納米抗體在畢赤酵母的高效分泌表達[D].華南理工大學.2021.