注：本文不構(gòu)成任何投資意見和建議，以官方/公司公告為準(zhǔn)；本文僅作醫(yī)療健康相關(guān)藥物介紹，非治療方案推薦（若涉及），不代表耀海生物立場。任何文章轉(zhuǎn)載需得到授權(quán)。

文章導(dǎo)讀

科研人員在創(chuàng)新藥等生物制藥的過程中，建立菌種庫的意義在于利用菌種庫系統(tǒng)進(jìn)行充分的質(zhì)量檢測并以此最大程度的控制和減少污染和菌種的性質(zhì)改變。科研人員為了達(dá)到菌種庫建立的目的，在建立菌種庫時(shí)需要菌種庫具備足夠數(shù)量的菌種和維持菌種的均質(zhì)性，用以確保研發(fā)和生產(chǎn)過程中所用的菌種的來源的一致性。

菌種庫構(gòu)建過程主要需要注意以下幾個(gè)方面

1. 建庫用菌種的溯源性

2. 菌種建庫過程合規(guī)性

3. 建庫菌種的檢定要求

4. 菌種傳代穩(wěn)定性研究

菌種建庫建立的三級(jí)種子庫包括

1. 原始種子庫(pre-master cell bank/research cell bank, PCB/RCB）

2. 主代種子庫(master cell bank,MCB)：從原始種子批傳代、擴(kuò)增后保存的為主種子庫

3. 工作種子庫(working cell bank,WCB)：從主種子庫進(jìn)行批傳代、擴(kuò)增后保存即為工作種子庫

每批種子庫都應(yīng)按規(guī)程的要求進(jìn)行保管、檢定和使用。為了保障生物制品的安全性，必須對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的檢測，確定其達(dá)到相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)要求。耀海生物的菌種庫建立以及菌種保存均是依照國家GMP體系的要求執(zhí)行，并且為了確保產(chǎn)線的穩(wěn)定運(yùn)行與菌種庫的安全，耀海生物還將WCB單獨(dú)存放。

1. 一、溯源性

為保證菌種的可溯源性菌種庫構(gòu)建資料要求具備基因、載體和宿主細(xì)胞的來源及改造過程。其來源明確清晰，切實(shí)可靠，其演化歷史也必須清楚。目的基因：為確保目的基因的可溯源性菌種庫必須確定其來源、設(shè)計(jì)和改造過程，并且要求來源明確清晰，歷史演化過程清楚。表達(dá)載體：為保證表達(dá)載體的可溯源性菌種庫構(gòu)建資料要求具備表達(dá)載體的來源、名稱、結(jié)構(gòu)等信息，說明重組質(zhì)粒的構(gòu)建和檢定過程。載體來源應(yīng)當(dāng)清楚，明確其出處以及可靠性。宿主細(xì)胞：宿主細(xì)胞的來源要明確，提供其名稱、生物學(xué)特性，檢定結(jié)果等信息。

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2. 二、菌種建庫過程合規(guī)性

建庫流程：依照法規(guī)規(guī)定，從篩選到的高表達(dá)菌株單克隆經(jīng)反復(fù)純化擴(kuò)增驗(yàn)證后，凍存于-80℃，即為原始種子庫。取一只原始種子，復(fù)蘇后擴(kuò)增驗(yàn)證，然后混合一定濃度的甘油后在-80℃凍存，即為主種子庫。取主種子進(jìn)行復(fù)蘇后擴(kuò)增驗(yàn)證，然后混合一定濃度的甘油后在-80℃凍存，即為工作種子庫。所有的種子都要嚴(yán)格記好株名、批號(hào)、編號(hào)、凍存日期、分裝數(shù)量、放置位置及取用記錄等。①需在GMP體系完成建庫工作，建庫流程、儲(chǔ)存、運(yùn)輸過程都要形成SOP管理文件。②保證均質(zhì)性，如果是使用了多個(gè)容器培養(yǎng)，分裝前需要有合適的方法充分混勻。③為保證工作種子庫、主種子庫與原始種子庫的生物學(xué)特性一致，建庫過程中不得有單克隆挑選和菌種篩選的行為。星耀小TIP：GMP標(biāo)準(zhǔn)（藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范）是為保證藥品在規(guī)定的質(zhì)量下持續(xù)生產(chǎn)的體系。它是為把藥品生產(chǎn)過程中的不合格的危險(xiǎn)降低到最小而訂立的。GMP包含方方面面的要求，從廠房到地面、設(shè)備、人員和培訓(xùn)、衛(wèi)生、空氣和水的純化、生產(chǎn)和文件。

1. 三、建庫菌種的檢定要求

①菌落形態(tài)及抗生素抗性，考察菌種在含與不含抗生素培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)及抗生素抗性。②生化反應(yīng)，考察工程菌是否具有典型的大腸桿菌生化反應(yīng)。③染色鏡檢，考察工程菌菌體形態(tài)及革蘭氏類別。④重組表達(dá)載體酶切檢定，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒酶切后DNA片段大小符合理論值。⑤基因序列測序，驗(yàn)證重組表達(dá)載體上的目的基因序列的正確性。⑥電鏡觀察，通過電鏡觀察菌體形態(tài)，支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染情況。⑦菌體目的蛋白表達(dá)檢定，通過SDS-PAGE檢測分析重組質(zhì)粒是否表達(dá)目的蛋白。⑧菌體表達(dá)蛋白免疫原性檢查，通過Western-blot檢測分析重組質(zhì)粒表達(dá)的重組蛋白是否具有正確的免疫原性。《中國藥典》三部中規(guī)定了細(xì)胞基質(zhì)的質(zhì)量要求，包括：細(xì)胞鑒別（種屬、株及專屬特性）；外源因子污染檢查（包括病毒性及非病毒性內(nèi)外源因子）；成瘤性及致瘤性檢測；染色體核型；均一性及穩(wěn)定性等。

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2. 四、菌種傳代穩(wěn)定性研究

根據(jù)《中華人民共和國藥典》相關(guān)要求，種子庫要開展傳代穩(wěn)定性研究，明確限傳代次數(shù)，使用壽命，評(píng)估是否能夠滿足未來商業(yè)化生產(chǎn)需求。在開展傳代穩(wěn)定性研究時(shí)應(yīng)在模擬實(shí)際的生產(chǎn)條件下開展。通常對(duì)重組質(zhì)粒穩(wěn)定性和表達(dá)穩(wěn)定性研究的方法為：對(duì)種子庫菌種多代次培養(yǎng)，通過雙酶切檢測與菌體PCR檢測，確定傳代50次后質(zhì)粒是否丟失。通過對(duì)傳代50代的菌液誘導(dǎo)培養(yǎng)后，對(duì)菌體表達(dá)的目的蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE檢測，確定傳代后的表達(dá)穩(wěn)定性。

耀海生物擁有GMP級(jí)別的菌種建庫環(huán)境以及符合藥品注冊申報(bào)的車間環(huán)境，可滿足項(xiàng)目中目的蛋白的產(chǎn)量和純度穩(wěn)定性。

GMP潔凈車間廠址環(huán)境和總圖布置符合的條件是環(huán)境無污染、廠區(qū)要整潔、區(qū)間不妨礙發(fā)展有余地。耀海生物有整潔的生產(chǎn)環(huán)境，廠區(qū)的地面、路面及運(yùn)輸?shù)炔粫?huì)對(duì)制品的生產(chǎn)造成污染，生產(chǎn)、行政、生活和輔助區(qū)的總體布局合理，廠區(qū)和廠房內(nèi)的人、物流走向應(yīng)當(dāng)合理。耀海生物廠房所處的環(huán)境能夠盡量降低物料或產(chǎn)品遭受污染。關(guān)于GMP潔凈區(qū)的分級(jí)要求可參考下圖。

總結(jié)

綜上所述，三級(jí)菌種庫的建立不僅僅是為了為菌種的保存和追溯提供切實(shí)的依據(jù)，而且是在GMP審查以及IND申時(shí)所必需的數(shù)據(jù)來源。因此在建立三級(jí)菌種庫之時(shí)所需要考慮的不僅包括菌種庫本身的基本要求，而且要把IND申報(bào)的要求考慮在內(nèi)。在保證符合國家關(guān)于菌種庫建立的要求之外，符合IND申報(bào)和GMP體系的要求。
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