今天給同學(xué)們分享一篇腸道微生物群+孟德爾隨機(jī)化的生信文章“Identifying and ranking causal microbial biomarkers for colorectal cancer at different cancer subsites and stages: a Mendelian randomization study”，這篇文章于2023年7月19日發(fā)表在Front Oncol期刊上，影響因子為5.738。

腸道微生物組直接參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生，但關(guān)于腸道微生物組對結(jié)直腸癌（CRC）風(fēng)險影響的流行病學(xué)證據(jù)大多來自觀察性研究，目前還不清楚已確定的微生物改變是導(dǎo)致 CRC 發(fā)生的原因還是結(jié)果。

圖1 孟德爾隨機(jī)化分析的研究設(shè)計

1. 單變量 MR

排除不符合IV標(biāo)準(zhǔn)的SNP后，3310個SNP與412個微生物性狀密切相關(guān)。為了評估IV的強(qiáng)度，計算了每個SNP的F值，IV的F統(tǒng)計量介于408和797之間，均大于10，表明不存在弱工具變量偏差。通過 Phenoscanner 查詢，發(fā)現(xiàn) rs2450114 與 BCR 和 BR 密切相關(guān)（P < 1×10 -5 ），因此刪除該 SNP，繼續(xù)進(jìn)行 MR 分析。

利用IVW（M）、Wald比率和MR Egger方法，我們發(fā)現(xiàn)40個微生物性狀與CRC、56個微生物性狀與CC、43個微生物性狀與CR、45個微生物性狀與BCR、40個微生物性狀與BC、43個微生物性狀與BR之間存在潛在的因果關(guān)系（P < 0.05），其中12個微生物性狀與CRC、20個微生物性狀與CC、12個微生物性狀與CR、10個微生物性狀與BCR、9個微生物性狀與BC、14個微生物性狀與BR之間存在明顯的因果關(guān)系（IVW（M）MR，P fdr < 0.2）。結(jié)腸和直腸的腸道微生物生物標(biāo)志物也存在差異。詳見圖 2、圖 3。

圖2 微生物性狀對惡性腫瘤因果效應(yīng)的 MR 森林圖

圖3 微生物性狀對良性腫瘤因果效應(yīng)的 MR 森林圖

關(guān)于微生物性狀與惡性腫瘤之間的因果關(guān)系，IVVW（M）分析表明，鏈球菌是 CRC（OR = 0.804，95%CI = 0.691 ~ 0.935，P = 0.005）和 CC（OR = 0.844，95%CI = 0.770 ~ 0.925，P = 0.0003）的顯著保護(hù)因子。此外，經(jīng) FDR 校正后發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌（OR = 0.802，95%CI = 0.688 ~ 0.936，P = 0.005）和嗜酸鏈球菌（OR = 0.843，95%CI = 0.734 ~ 0.968，P = 0.015）與 CRC 存在負(fù)因果關(guān)系。Eubacterium ventriosum（OR = 0.781，95%CI = 0.684 ~ 0.892，P = 0.0003）是 CC 的保護(hù)因子；Erysipelotrichaceae（OR = 0.800，95%CI = 0.685 ~ 0.935，P = 0.005）、Coprococcus sp_ART55_1 （OR = 0.749，95%CI = 0.586 ~ 0.956，P = 0.021）和 Eubacterium siraeum （OR = 0.716，95%CI = 0.527 ~ 0.973，P = 0.033）對 CR 有潛在的保護(hù)作用。

結(jié)果表明，腸道微生物性狀與良性腫瘤之間存在因果關(guān)系。卵形乳桿菌與 BCR（OR = 1.12，95%CI = 1.01 ~ 1.23，P = 0.03）、BC（OR = 1.12，95%CI = 1.01 ~ 1.25，P = 0.04）和 BR（OR = 1.17，95%CI = 1.02 ~ 1.35，P = 0.03）呈提示性因果關(guān)系。未分類的 Sutterellaceae（OR = 0.785，95%CI = 0.636 ~ 0.969，P = 0.024）與 BR 有因果關(guān)系。MR Egger 分析表明，青春期雙歧桿菌對 BCR（OR = 1.666，95%CI：1.100 ~ 2.524，P = 0.043）和 BC（OR = 1.584，95%CI = 1.088 ~ 2.305，P = 0.042）是一種潛在的危險微生物。

Cochran's Q 統(tǒng)計顯示，只有 GLYCOCAT PWY：糖原降解 I：細(xì)菌.CC 存在異質(zhì)性（Q = 23.412，Q_pval = 0.005）。剔除 MR-PROSSO 分析中顯示水平多向性的 SNPs 后，IVs 中沒有異質(zhì)性（Q_pval > 0.05）。雖然有一些潛在的生物標(biāo)志物（如青春期雙歧桿菌和 Sutterellaceae 等）在 IVW(M) 分析結(jié)果中沒有顯示出相關(guān)性，但 MR-Egger 分析顯示這些生物標(biāo)志物的遺傳變異之間存在一定程度的褶積性，而且 MR-Egger 和 MR-PROSSO 的結(jié)果顯示與結(jié)果存在潛在的因果關(guān)系。此外，MR-Egger 分析表明，其他微生物性狀不存在水平多向性（P > 0.05）。MR-PRESSO 結(jié)果顯示，Sutterellaceae 和 CRC（P = 0.006，多重 SNPs：rs2004833、rs28517505 和 rs59033852）、GLYCOCAT PWY：糖原降解 I：細(xì)菌和 CC（P = 0.009，多態(tài)性 SNP：rs115001375 和 rs59657730）、Bilophila wadsworthia 和 BCR（P = 0.035，多態(tài)性 SNP：rs10276776）、Bilophila wadsworthia 和 BR（P = 0.007，多態(tài)性 SNP：rs10276776）、Eubacterium hallii 和 BR（P = 0.017，多態(tài)性 SNP：rs1330325）。剔除異常值后，結(jié)果發(fā)生了很大變化，Sutterellaceae 與 CRC（OR = 0.85，95% CI = 0.66 ~ 1.10，P = 0.23）、Bilophila wadsworthia 與 CRC（OR = 0.91，95% CI = 0.79 ~ 1.06，P = 0.243）、Eubacterium hallii 與 BR（OR = 1.056，95% CI = 0.854 ~ 1.306，P = 0.616）之間沒有因果效應(yīng)。GLYCOCAT PWY：糖原降解 I：細(xì)菌，Bilophila wadsworthia 與 CC（OR = 0.929，95% CI = 0.551 ~ 0.966，P = 0.028，Q_pval = 0.229）和 BR（OR = 0.712，95% CI = 0.515 ~ 0.984，P = 0.040, Q_pval = 0.324）。其他微生物性狀的 MR-PROSSO 結(jié)果顯示沒有水平多效性（P > 0.05），或者 MR-PROSSO 無法識別多效性 SNPs。此外，MR Steiger 分析表明，從暴露到結(jié)果之間存在正向因果關(guān)系（所有 P < 7×10 -5 ），而且同位分析發(fā)現(xiàn)暴露和結(jié)果的變化不是由相同的潛在遺傳變異引起的（基于 PP.H4.abf < 0.8），這表明因果回歸返回的因果效應(yīng)估計值是無偏的。

我們將這些微生物性狀與六種非結(jié)腸直腸癌疾病進(jìn)行了雙樣本單變量 MR 分析，以探討這些細(xì)菌是否是結(jié)腸直腸癌的特異性生物標(biāo)志物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未分類的蘇特雷科細(xì)菌也是一種對非酒精性脂肪肝有顯著保護(hù)作用的微生物（OR = 0.811，95% CI = 0.705 ~ 0.934，P = 0.004），而赤蘚紅菌科細(xì)菌能顯著降低腸易激綜合征的風(fēng)險（OR = 0.897，95% CI = 0.844 ~ 0.954，P = 0.0006）。

2. 潛在生物標(biāo)志物排名

我們使用 MR-BMA 對名義上與 MR 結(jié)果顯著相關(guān)的微生物生物標(biāo)記物進(jìn)行排序，根據(jù)其 MIP > 0.1。對于惡性腫瘤：CRC 的前三個生物標(biāo)志物是假黃桿菌（MIP = 0.91，MACE = 0.26）、嗜熱鏈球菌（MIP = 0.56，MACE = -0.11）和貓科動物球菌（MIP = 0.43，MACE = -0.11）。與 CC 相關(guān)的生物標(biāo)志物有：伽馬蛋白菌（MIP = 0.20，MACE = -0.03）、Eubacterium ventriosum（MIP = 0.17，MACE = -0.03）、Holdemania unclassified（MIP = 0.15，MACE = -0.02）和 Sutterella wadsworthensis（MIP = 0.14，MACE = -0.02）。與 CR 相關(guān)的生物標(biāo)志物是 Coprococcus sp_ART55_1（MIP = 0.45，MACE = -0.09）、Desulfovibrio（MIP = 0.36，MACE = -0.11）和 Erysipelotrichaceae（MIP = 0.17，MACE = -0.04）。

就良性腫瘤而言，BCR 的危險因素是類桿菌屬（MIP = 0.43，MACE = 0.063）、青春期雙歧桿菌屬（MIP = 0.34，MACE = -0.05）、卵形乳桿菌屬（MIP = 0.23，MACE = 0.03）和未分類的 Subdoligranulum（MIP = 0.14，MACE = -0.02）。BC 的風(fēng)險因素只有卵形乳桿菌（MIP = 0.81，MACE = 0.12）。BR 的風(fēng)險因素有三個：酸性球菌科（MIP = 0.82，MACE = -0.17）、直腸桿菌科（MIP = 0.35，MACE = -0.09）和未分類的 Sutterellaceae（MIP = 0.15，MACE = -0.02）。所有其他風(fēng)險因素的 MIP 均小于 0.1。這些生物標(biāo)志物的 MACE 方向也與我們的 MR 結(jié)果一致。在對 CC 和 CR 的初步分析中，影響點的檢測分別突出了 rs12736307 和 rs76321722，它們對分析的影響更大。其余結(jié)果中的遺傳變異與較大的 q 統(tǒng)計量或庫克距離不一致。

3. 微生物風(fēng)險因素識別

在本節(jié)中，我們選擇了 MIP 值排名前 10 的微生物作為結(jié)果的 "真正 "因果風(fēng)險因素。其中，MIP 大于 0.2 并與其他分析結(jié)果交叉驗證的結(jié)果如下：在惡性腫瘤方面，嗜熱鏈球菌（MIP = 0.36，MACE = -0.037）和紅細(xì)胞菌（MIP = 0.138，MACE = -0.018）是 CRC 的風(fēng)險因素。CC中風(fēng)險最高的微生物性狀是通風(fēng)桿菌（MIP = 0.219，MACE = -0.029）和鏈球菌（MIP = 0.118，MACE = -0.017）。CR 的風(fēng)險因素包括 Erysipelotrichaceae（MIP = 0.284，MACE = -0.064）、Eubacterium siraeum（MIP = 0.106，MACE = -0.021）和 Coprococcus sp_ART55_1（MIP = 0.103，MACE = -0.011）。對于良性腫瘤，BCR 的風(fēng)險因素包括卵形乳桿菌（MIP = 0.178，MACE = -0.017）和青春期雙歧桿菌（MIP = 0.043，MACE = -0.003）。而與 BC（MIP = 0.032，MACE = 0.002）和 BR（MIP = 0.136，MACE = 0.022）相關(guān)的風(fēng)險因素有卵菌。微生物風(fēng)險因素鑒定的結(jié)果，檢測出 BR 的影響點突出 rs9884588，對分析影響較大。其余結(jié)果中的遺傳變異都沒有較大的 q 統(tǒng)計量或一致的 Cd，也沒有需要剔除的異常值或影響點。

4. NetMoss 分析

利用 NetMoss 方法，我們發(fā)現(xiàn)卵形乳桿菌和未分類的 Sutterellaceae 是區(qū)分腺瘤和健康人群的生物標(biāo)志物（圖 4A）。Erysipelotrichaceae, Sutterellaceae, Streptococcus, Bacteroides ovatus 和 Eubacterium siraeum 是區(qū)分 CRC 和健康人群的生物標(biāo)志物（圖 4D）。上述方法中的這些生物標(biāo)志物表明它們與 CRC 的發(fā)生有因果關(guān)系。同時，我們也發(fā)現(xiàn)了一些與 MR 結(jié)果不一致的微生物（圖 4A-I）。

圖4 NetMoss 結(jié)果圖

5. 中介分析

由于膳食習(xí)慣對預(yù)防和治療 CRC 至關(guān)重要，而腸道微生物群可能是不同癌癥亞位點和分期的膳食習(xí)慣對 CRC 影響的中介。通過 "系數(shù)乘積 "法，我們共發(fā)現(xiàn)了 20 條膳食習(xí)慣調(diào)節(jié)腸道細(xì)菌進(jìn)而影響 CRC 發(fā)生和發(fā)展的因果通路（圖 5 和表 3），其中 10 條因果通路的中介方向與膳食習(xí)慣-結(jié)果方向一致。包括目前的飲酒狀況對 CC 的影響部分由 Eubacterium ventriosum（間接效應(yīng)（β）= 4.748，P=0.002，中介比例為 43.044%）中介；膳食纖維對 CC 的影響部分由 Eubacterium ventriosum（間接效應(yīng)（β）= 4.748，P=0.002，中介比例為 43.04443.044%）；谷物類型：餅干谷物（如維他谷物）可能會通過降低嗜熱鏈球菌的豐度來降低患 CRC 的風(fēng)險（β = -0.417，P = 0.941，介導(dǎo)比例：13.973%）；攝入過多的鐵蛋白會導(dǎo)致嗜熱鏈球菌豐度下降，進(jìn)而導(dǎo)致患 CRC 的風(fēng)險增加（β = 0.09，P = 0.02，介導(dǎo)比例：34.22%）；卵形乳桿菌介導(dǎo)了礦物質(zhì)和其他膳食補(bǔ)充劑的影響：鈣（β = 0.327，P = 0.053，介導(dǎo)比例：11.854%）和面包攝入量（β = 0.068，P = 0.041，介導(dǎo)比例：12.639%）。最后，通過青少年雙歧桿菌估計了從不/很少喝牛奶對 BCR 的間接影響，發(fā)現(xiàn)青少年雙歧桿菌的中介效應(yīng)為 23.453，中介比例為 435.399%。

圖5 飲食-腸道細(xì)菌-大腸癌路徑圖的介導(dǎo)分析

總結(jié)

總之，本研究進(jìn)行了一項全面的探索性孟德爾隨機(jī)化研究，發(fā)現(xiàn)了 6 種對惡性腫瘤有保護(hù)作用的細(xì)菌、2 種風(fēng)險細(xì)菌和 1 種對良性腫瘤有保護(hù)作用的細(xì)菌。研究結(jié)果支持腸道微生物群是 CRC 病因的假說，而且對不同癌癥亞部位和分期的 CRC 的影響不同，表明微生物對 CRC 的預(yù)防、治療和改善具有特異性。其中，嗜熱鏈球菌對 CRC 的保護(hù)作用已被細(xì)胞和動物實驗所驗證。同時，中介分析的結(jié)果為改變飲食習(xí)慣來調(diào)節(jié)腸道細(xì)菌，進(jìn)而影響不同癌癥亞位點和不同階段的 CRC 提供了理論支持和實證證據(jù)，表明控制腸道菌群可能是特定飲食人群預(yù)防結(jié)直腸癌的一種有前景的策略。此外，這些發(fā)現(xiàn)還為進(jìn)一步的機(jī)理研究（如動物模型或基于生物標(biāo)志物的人體試驗）提供了思路和方向，有助于指導(dǎo)基于微生物群的潛在癌癥預(yù)防策略的開發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化。