腺相關病毒滴度檢測采用實時熒光定量PCR法：

滴度單位：vg/mL，指每毫升中含有的病毒基因組拷貝數(shù)。"vg"為Vector Genomes的縮寫，指病毒基因組的數(shù)量。

I.?檢測步驟

①使用DNase I 及蛋白酶K消化AAV病毒樣品。

②稀釋標準品質(zhì)粒，設置標準品的拷貝梯度為105?、106?、107?、108?、109?、1010???。

③配置QPCR反應體系，每個樣品和標準品設計3個復孔，進行QPCR反應。

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II. 數(shù)據(jù)分析（以HBAAV2/9 -GFP 滴度測度為例）

①原始實驗數(shù)據(jù)。Roche LC96 實時熒光定量PCR儀所測Ct值數(shù)據(jù)如下：

②標準曲線制作。以每組AAV標準品的Ct均值為縱坐標Y，其對應的拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標X，做標準曲線，得出標準曲線的函數(shù)公式及R平方值。

③待測樣品滴度計算。將待測AAV樣品Ct均值，代入②所得公式，計算所加入AAV模板拷貝數(shù)X，再換算成滴度。換算公式為：AAV病毒滴度= 10x?×400000（稀釋倍數(shù)）vg/mL

對照病毒HBAAV2/9-GFP滴度=1.6×10^12?vg/mL

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Q:?不同滴度測定方法有什么有優(yōu)缺點？
A:?pfu比較經(jīng)典，但重復性不好，且檢測時間周期長；efu簡單耗時短，但需要穿梭質(zhì)粒帶熒光；TCID50可準確測定具有感染力的病毒滴度，檢測周期適中；VI只能用于純化后的病毒，檢測顆粒數(shù)而不是活性病毒滴度。
Q：標準品的標準曲線公式中R2有什么作用？

A:R2代表相關系數(shù)，一般機器默認的是R2>0.99，這樣才具有可行度和線性關系
Q:?保存過久的病毒需要重新檢測滴度嗎？
若在短期內(nèi)使用，可將病毒放置于4℃保存，應盡快使用；如需長期保存則應放置于-80℃，如超過六個月，建議在使用前重新測定病毒滴度。
Q:?腺相關病毒為什么不常使用PFU、TCID50等方式檢測滴度？
A:?AAV?感染不會導致細胞病變效應，因此，空斑實驗不能用于確定其感染滴度，而TCID50法一般需要利用腺病毒作為輔助病毒，另一方面，常用的活性顆粒檢測方法需要在細胞中檢測，AAV基因的表達需要較長時間，檢測效率低?；蚪M滴度以AAV衣殼中所含基因組含量作為定量依據(jù)，測定的是含目標基因組的AAV濃度，方法簡單高效。