肺癌是全球高度流行的癌癥，與之相關(guān)的死亡率占癌癥總死亡率的22%[1]。肺癌與吸煙密切相關(guān)，在85%非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者中，吸煙者風(fēng)險顯著高于不吸煙者，且因此死亡的風(fēng)險也更高[2]。眾多研究表明，吸煙是NSCLC發(fā)展的危險因素，但吸煙促進(jìn)NSCLC進(jìn)展的生物學(xué)機制仍不清楚。

m6A是一種廣泛存在于mRNA上的堿基修飾行為，參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的促腫瘤和抗腫瘤功能。去甲基化酶ALKBH5通過調(diào)節(jié)mRNA的m6A修飾水平，在癌癥進(jìn)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用。因此，檢查ALKBH5的核質(zhì)分布對于理解m6A修飾在腫瘤發(fā)生中的作用至關(guān)重要。然而，吸煙引起的NSCLC中m6A修飾的分子機制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

2023年5月28日，南京醫(yī)科大學(xué)吳昊主任和劉起展教授團(tuán)隊在Advanced Science(Weinh)發(fā)表文章Smoking-Induced M2-TAMs, via circEML4 in EVs, Promote the Progression of NSCLC through ALKBH5-Regulated m6A Modification of SOCS2 in NSCLC Cells。作者發(fā)現(xiàn)了M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（M2-TAM）在吸煙誘導(dǎo)的NSCLC組織周圍積累會促進(jìn)其腫瘤進(jìn)展。經(jīng)煙草煙霧（CSE）誘導(dǎo)后，M2-TAM的細(xì)胞外囊泡（EV）中的環(huán)狀RNA circEML4表達(dá)水平升高，且含有circEML4的EV被轉(zhuǎn)運至NSCLC細(xì)胞。其中，circEML4與ALKBH5相互作用，減少了ALKBH5在細(xì)胞核中的分布，導(dǎo)致SOCS2的m6A修飾水平升高，激活JAK-STAT途徑?？偟膩碚f，CSE誘導(dǎo)的M2-TAM通過EV中的circEML4與ALKBH5互作來調(diào)節(jié)SOCS2的m6A修飾水平，在NSCLC中起促腫瘤功能。這項研究表明，存在于M2-TAM的EV中的circEML4可作為診斷NSCLC的生物標(biāo)志物。

CSE在體內(nèi)外均誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生M2極化并促進(jìn)NSCLC惡性發(fā)展

作者通過logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，在NSCLC患者中，吸煙與腫瘤分級、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤最大直徑呈正相關(guān)。經(jīng)免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，與非吸煙者的NSCLC細(xì)胞相比，吸煙患者iNOS（M1-TAM的生物標(biāo)志物）的表達(dá)水平較低，而CD163和CD206（M2-TAM的生物標(biāo)志物）的表達(dá)水平增強。通過免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NSCLC患者的組織中，CD206的表達(dá)水平與吸煙程度呈正相關(guān)，表明吸煙通過增加M2-TAM的積累來促進(jìn)NSCLC的進(jìn)展。作者進(jìn)一步通過免疫熒光和qRT-PCR驗證了CSE誘導(dǎo)的THP-M細(xì)胞極化為M2，且在該條件下的A549和H1703細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲增強，而且在體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)CSE-THP-M與A549混合的小鼠的腫瘤體積和重量與對照組相比更大。綜上表明，CSE在體內(nèi)外均誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生M2極化并促進(jìn)NSCLC惡性腫瘤的進(jìn)展。

CSE使M2-TAM分泌EV來促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的進(jìn)展

作者使用透射電子顯微鏡觀察到了EV的形狀，而且通過EdU法證明CSE-THP-M衍生的EV增強了A549和H1703細(xì)胞的增殖能力。用來自CSE-THP-M的EV處理A549和H1703細(xì)胞，結(jié)果顯示其細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力顯著增強?；貧w到動物實驗發(fā)現(xiàn)，來自CSE-THP-M的EV使A549細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤體積和重量增加，而且與THP-M-EV組相比，CSE-THP-M-EV治療組的腫瘤細(xì)胞中Ki67陽性數(shù)量增加。綜上表明，EV在CSE誘導(dǎo)M2-TAM促進(jìn)NSCLC腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

在CSE誘導(dǎo)M2-TAM的EV中，circEML4是促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的關(guān)鍵分子

作者通過生物信息學(xué)分析獲得13個在NSCLC組織中過表達(dá)的circRNA，而且qRT-PCR結(jié)果顯示circEML4在CSE-THP-M細(xì)胞和CSE-THP-M分泌的EV中表達(dá)水平上調(diào)。因此，作者設(shè)計引物擴增了circEML4，并用RNase R檢測其穩(wěn)定性，結(jié)果顯示circEML4對RNase R處理具有抗性，不易被降解。接著，作者運用siRNA干擾技術(shù)敲低circEML4在CSE-THP-M的EV中的表達(dá)水平，導(dǎo)致A549和H1703細(xì)胞增殖、遷移和侵襲減少，證實CSE誘導(dǎo)的M2-TAM通過EV中的circEML4促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的惡性生長。

circEML4與ALKBH5互作，使NSCLC細(xì)胞中m6A修飾水平增加

作者通過RNA pull-down和質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，circEML4與ALKBH5相互作用。結(jié)合m6A斑點雜交實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CSE-THP-M分離的EV處理后，A549和H1703細(xì)胞的m6A修飾水平上調(diào)，而敲低circEML4或抑制EV分泌則逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果。此外，RIP實驗進(jìn)一步證實了circEML4與A549和H1703細(xì)胞中ALKBH5的結(jié)合作用。WB結(jié)果顯示，當(dāng)A549和H1703細(xì)胞暴露于CSE-THP-M的EV刺激下（circEML4表達(dá)水平上調(diào)），ALKBH5在細(xì)胞質(zhì)中的分布增多，而在細(xì)胞核中的分布減少，但敲低circEML4使ALKBH5在細(xì)胞質(zhì)中的分布明顯減少，說明circEML4會直接影響ALKBH5的核質(zhì)分布水平。綜上表明，在CSE誘導(dǎo)M2-TAM的EV中，circEML4通過與ALKBH5結(jié)合來提高m6A水平。

circEML4通過ALKBH5調(diào)節(jié)SOCS2的m6A修飾以促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的進(jìn)展

作者在A549細(xì)胞中運用siRNA干擾敲低ALKBH5，再進(jìn)行m6A-seq和RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，m6A峰富集在3’-UTR，敲低ALKBH5后出現(xiàn)30880個新的m6A峰。接著，對m6A水平和mRNA水平差異表達(dá)基因進(jìn)行GSEA富集分析，富集了6種信號通路，其中JAK-STAT信號通路最顯著。進(jìn)一步分析JAK-STAT途徑中的基因表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，敲低ALKBH5使該通路中關(guān)鍵基因SOCS2的mRNA水平降低。而且，泛癌分析結(jié)果顯示，SOCS2的表達(dá)水平在許多癌癥中均下調(diào)。通過meRIP-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，敲低ALKBH5使SOCS2的m6A水平上調(diào)。此外，敲低ALKBH5可以逆轉(zhuǎn)敲低circEML4對A549和H1703細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用?？傊?，在CSE誘導(dǎo)的M2-TAM的EV中，circEML4通過ALKBH5調(diào)節(jié)SOCS2的m6A修飾以促進(jìn)NSCLC細(xì)胞生長。

敲低circEML4可阻止CSE誘導(dǎo)M2-TAM中EV促進(jìn)NSCLC腫瘤進(jìn)展

作者通過小鼠體內(nèi)實驗證明，與對照組相比，來自CSE-THP-M-circEML4 siRNA組的EV引起的腫瘤體積和重量較少。此外，通過IHC染色和WB結(jié)果顯示，與對照組相比，CSE-THP-M-circEML4 siRNA組小鼠的Ki67、p-JAK2和p-STAT5水平較低，SOCS2的表達(dá)水平較高。接著，作者用尾靜脈注射法將經(jīng)CSE-THP-M-circEML4 siRNA處理的EV注射到小鼠中，通過蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，肺部腫瘤樣轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較少，且小鼠血漿中circEML4表達(dá)水平較低。綜上表明，在CSE誘導(dǎo)的M2-TAM的EV中，circEML4參與促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。

吸煙與NSCLC組織中SOCS2/JAK-STAT信號通路的激活密切相關(guān)

作者通過電子顯微鏡和WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非吸煙患者相比，吸煙者的血漿EV中circEML4的表達(dá)水平更高。在吸煙患者的NSCLC組織中，circEML4的表達(dá)量與吸煙水平呈正相關(guān)。WB結(jié)果顯示，與從不吸煙的患者相比，吸煙患者的NSCLC組織中SOCS2蛋白較低。而且，SOCS2的表達(dá)量與吸煙水平呈負(fù)相關(guān)。此外，circEML4與吸煙患者NSCLC組織中的SOCS2呈負(fù)相關(guān)。最后，IHC結(jié)果顯示，與非吸煙患者相比，吸煙的NSCLC患者中p-JAK2和p-STAT5的表達(dá)水平上調(diào)，而SOCS2的表達(dá)水平下調(diào)。以上數(shù)據(jù)表明，M2-TAM的EV中的circEML4通過SOCS2/JAK-STAT信號通路參與吸煙誘導(dǎo)的NSCLC形成過程。

總結(jié)

吸煙導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的M2極化，進(jìn)而導(dǎo)致M2-TAM在NSCLC組織周圍積累，以及circEML4表達(dá)水平上調(diào)。circEML4通過EV從M2-TAM轉(zhuǎn)運至NSCLC細(xì)胞，與ALKBH5結(jié)合使其在核內(nèi)分布減少，導(dǎo)致SOCS2的m6A修飾水平增加，進(jìn)一步激活JAK-STAT信號傳導(dǎo)途徑，并最終促進(jìn)NSCLC腫瘤惡性發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

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原文鏈接：

https://doi.org/10.1002/advs.202300953