Gibson克隆是一種DNA無縫克隆技術(shù)，可將插入片段定向克隆到載體的任意位點(diǎn)。將載體進(jìn)行線性化，在插入片段正/反向PCR引物5'端引入線性化載體的末端序列，使得PCR產(chǎn)物5'和3'最末端分別帶有和線性化載體兩末端一致的序列(15 - 20 bp)。這種PCR產(chǎn)物和線性化載體按一定比例混合后，在重組酶的催化下在一定的溫度反應(yīng)一定的時(shí)間即可完成定向克隆。

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A. 載體線性化 B. PCR獲得帶有同源臂的插入片段 C. 重組反應(yīng) D. 轉(zhuǎn)化感受態(tài)

實(shí)驗(yàn)流程：

線性化載體制備

（1）選擇合適的克隆位點(diǎn)，對(duì)載體進(jìn)行線性化。盡量選擇無重復(fù)序列且載體克隆位點(diǎn)上下游20 bp區(qū)域內(nèi)GC含量在40% - 60%之間的位點(diǎn)進(jìn)行克隆。

（2）選擇合適的載體線性化方式：限制性內(nèi)切酶消化或反向PCR擴(kuò)增

（2.1）酶切制備線性化載體時(shí)，推薦使用雙酶切方法使載體線性化完全，降低轉(zhuǎn)化背景(假陽性克隆)；若使用單酶切線性化，可以適當(dāng)延長酶切時(shí)間以減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留，降低轉(zhuǎn)化背景（如酶的說明書是切30min，那么可適當(dāng)延長至60min）（以Thermo-Fast Digest NotI酶為例）。

（2.2）反向PCR擴(kuò)增制備線性化載體時(shí)，推薦使用高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，減少擴(kuò)增突變的引入。50 μl的PCR體系中，推薦使用0.1 - 1 ng環(huán)狀質(zhì)粒模板，或使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為模板，以減少環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留對(duì)克隆陽性率的影響。

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1.?選擇已知序列中沒有而兩側(cè)都存在的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)切割；

2.?將酶切片段在連接酶作用下環(huán)化，使已知序列位于環(huán)狀分子上；

3.?根據(jù)已知序列的兩端設(shè)計(jì)兩個(gè)引物，以環(huán)狀分子為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出已知序列兩側(cè)的未知序列。

2.插入片段獲得

（1）引物設(shè)計(jì)：在插入片段正反向擴(kuò)增引物的5’端引入線性化載體兩末端同源序列，使擴(kuò)增后的插入片段5'和3'最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對(duì)應(yīng)一致的同源序列(15 - 20 bp，不包括酶切位點(diǎn))。

引物設(shè)計(jì)原則：同源臂(15 - 20 bp，不計(jì)算酶切位點(diǎn)和殘留堿基，GC含量40% - 60%)+ 酶切位點(diǎn)(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求保留或者舍棄) + 特異性引物(引物Tm值的計(jì)算不包括同源臂的序列)。

插入片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式為：

5'--上游載體末端同源序列 + 酶切位點(diǎn)(可保留或刪除) + 基因特異性正向擴(kuò)增引物序列--3'

插入片段反向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式為：5'--下游載體末端同源序列 + 酶切位點(diǎn)(可保留或刪除) + 基因特異性反向擴(kuò)增引物序列--3'

（上/下游載體末端同源序列即線性化載體最末端序列(用于同源重組)，GC含量40% - 60%）

（基因特異性正/反向擴(kuò)增引物序列即常規(guī)插入片段正/反向擴(kuò)增引物序列，Tm值60 ~ 65℃）

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1. 根據(jù)自身需要保留或刪除酶切位點(diǎn) 2. 計(jì)算退火溫度時(shí)，只計(jì)算基因特異性擴(kuò)增序列的Tm值，引入的同源序列和酶切位點(diǎn)不參與計(jì)算 3.引物長度超過40bp時(shí)，在引物合成時(shí)可以選用PAGE純化方式，提高陽性克隆率 4.插入片段有多個(gè)重復(fù)序列時(shí)，可以根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)需要添加一部分堿基設(shè)計(jì)引物）

（2）插入片段PCR擴(kuò)增

使用高保真聚合酶擴(kuò)增，無需考慮產(chǎn)物末端有無A尾(重組過程中將被去除，在最終載體中不會(huì)出現(xiàn))。為了確保最優(yōu)條件，可以先設(shè)置梯度PCR確定最佳退火溫度。按照高保真聚合酶的特性配置PCR體系，根據(jù)擴(kuò)增片段的大小設(shè)置合適的延伸時(shí)間，確定最佳的PCR條件（以Thermo高保真聚合酶為例）。

配置PCR體系

根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小確定extension時(shí)間，確定PCR條件。

?3. 膠回收純化線性化載體與插入片段

根據(jù)載體和插入片段的大小確定相應(yīng)濃度的膠進(jìn)行膠回收，不同的插入片段要更換新的刀片，防止外源DNA的污染。膠回收完成后瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證回收產(chǎn)物，Qubit測(cè)定插入片段和線性化載體的濃度以定量。

4. 線性化載體與插入片段的使用量計(jì)算

以Vazyme重組反應(yīng)體系為例，20 ul重組反應(yīng)體系中最適克隆載體使用量為0.03 pmol，最適插入片段使用量為0.06 pmol(載體與插入片段摩爾比為1:2)。這些摩爾數(shù)對(duì)應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式粗略計(jì)算獲得：

最適克隆載體使用量 = [0.02 × 克隆載體堿基對(duì)數(shù)] ng（0.03 pmol）

最適插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段堿基對(duì)數(shù)] ng（0.06 pmol）

例如，將長度為2 kb的插入片段克隆至長度為5 kb的克隆載體時(shí)，克隆載體的最適使用量應(yīng)為：0.02 × 5,000 = 100 ng；插入片段最適使用量應(yīng)為：0.04 × 2,000 = 80 ng。

注意：1. 當(dāng)插入片段長度大于克隆載體時(shí)，最適克隆載體與插入片段使用量的計(jì)算方式應(yīng)互換，即將插入片段當(dāng)做克隆載體，克隆載體當(dāng)做插入片段進(jìn)行計(jì)算。

2. 20 ul重組體系中線性化克隆載體的使用量應(yīng)在50 - 200 ng之間；插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用量應(yīng)在10 - 200 ng之間。當(dāng)使用上述公式計(jì)算DNA最適使用量超出這個(gè)范圍時(shí)，直接選擇最低/最高使用量即可。

3. 線性化克隆載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物未進(jìn)行DNA純化直接使用時(shí)，加入總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，即4 ul。

5. 重組反應(yīng)（Vazyme為例）

（1）計(jì)算重組反應(yīng)所需的線性化載體和插入片段所需DNA量

（2）稀釋線性化載體和重組片段，確保各組分加入量不低于1ul

（3）冰上配置反應(yīng)體系：

1.?可以根據(jù)自身需要配置10ul體系;?2. X/Y根據(jù)公式計(jì)算得到載體用量和插入片段用量;

（4）移液器輕輕吸打混勻(請(qǐng)勿振蕩混勻)，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

（5）PCR儀器37℃反應(yīng)30 min；降至4℃或立即置于冰上冷卻。重組產(chǎn)物可于-20℃存放一周，待需要時(shí)解凍轉(zhuǎn)化即可。

6. 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

（1）冰上解凍克隆感受態(tài)細(xì)胞(如：DH5α Competent cell）

（2）取10 μl重組產(chǎn)物加入到100 μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁混勻(請(qǐng)勿振蕩混勻)，冰上靜置30 min。

▲重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化體積最多不應(yīng)超過所用感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10（100ul感受態(tài)轉(zhuǎn)化的菌落可能又小又密，菌落PCR以及后續(xù)操作完成比較困難，可以根據(jù)需要減少感受態(tài)用量至20-50ul）

（3）42℃水浴熱激45 sec后，立即置于冰上冷卻3 min。

（4）加入500 μl SOC或LB培養(yǎng)基(不添加抗生素)，37℃搖菌1 h(轉(zhuǎn)速200 - 250 rpm)。

（5）LB固體培養(yǎng)基涂布相應(yīng)抗性，在37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。

（5）7,000 rpm離心3 min，棄掉500 μl上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻（可以根據(jù)自己想要的結(jié)果將重懸的菌液分開幾份涂布到相應(yīng)的抗性板上）。

（6）37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 - 16 h。

7. 重組反應(yīng)產(chǎn)物鑒定

（1）挑取LB板上的單克隆若干個(gè)進(jìn)行菌落PCR鑒定，菌落較小時(shí)，用牙簽先在PCR體系中涮幾下，再到裝有LB的離心管里面涮幾下。菌落較大時(shí)可以直接挑一半到PCR體系中，留一半做LB搖菌。做菌落PCR的單克隆要和之后LB搖菌的單克隆保持一致，注意做好標(biāo)記。

（2）擴(kuò)增引物盡量選擇載體骨架上的引物，根據(jù)自己所擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和使用的酶確定延伸時(shí)間和PCR程序。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)克隆正確時(shí)應(yīng)有長度略大于插入片段大小的條帶出現(xiàn)。

（3）菌落PCR鑒定為陽性的菌落，接種至含有適當(dāng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。

8. 提取質(zhì)粒

提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，或直接進(jìn)行一代測(cè)序。

蛋白的表達(dá)流程

原核表達(dá)載體的構(gòu)建→轉(zhuǎn)化到高效表達(dá)的宿主菌→目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)→細(xì)菌的擴(kuò)大培養(yǎng)→制備細(xì)菌蛋白粗提物→目的蛋白質(zhì)的純化。

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