前言

近日，同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院孫奮勇教授、上海交通大學(xué)石毅副研究員、上海市胸科醫(yī)院王佳誼研究員作為共同通訊作者，在?Clinical and Translational Medicine?(IF: 11.492) 雜志發(fā)表了題為“Tumour cells are sensitised to ferroptosis via RB1CC1-mediated transcriptional reprogramming”的研究論文，報(bào)道了腫瘤細(xì)胞通過 RB1CC1 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄重編程對(duì)鐵死亡敏感。

薛翔飛、馬麗芳、張驍博士為論文的共同第一作者，文章中轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、蛋白鑒定、ChIP-seq 及分析服務(wù)由歐易生物完成。

研究背景

鐵死亡是一種調(diào)控細(xì)胞死亡形式，其特點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧(ROS)過度依賴鐵的積累導(dǎo)致線粒體發(fā)生變化。觸發(fā)鐵死亡可以有效地治療對(duì)促凋亡和其他常規(guī)抗腫瘤治療耐藥的腫瘤細(xì)胞。因此，研究鐵死亡已成為腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)新的熱點(diǎn)和重要課題。然而，使腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感的信號(hào)通路和因素仍不明確。

研究?jī)?nèi)容

本研究對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq和蛋白質(zhì)組檢測(cè)，確定目標(biāo)分子RB1CC1。后續(xù)根據(jù)免疫印跡和免疫組織化學(xué)分析RB1CC1和相關(guān)蛋白的表達(dá)。通過構(gòu)建一系列RB1CC1突變體來確定RB1CC1的亞細(xì)胞定位，研究RB1CC1核易位對(duì)鐵死亡信號(hào)調(diào)節(jié)的機(jī)制。隨后為了檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中鐵死亡和 RB1CC1 依賴的轉(zhuǎn)錄程序，進(jìn)行了ChIP-seq測(cè)序。最后作者構(gòu)建肝癌小鼠模型去評(píng)估JNK激動(dòng)劑對(duì)加強(qiáng)咪唑酮雌激素(IKE)治療的影響，進(jìn)而闡明RB1CC1在基于IKE的肝腫瘤發(fā)生治療中的重要性。

研究思路

研究結(jié)果

RB1CC1使腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感

為了篩選潛在的脂質(zhì)ROS調(diào)控和鐵死亡相關(guān)因子，對(duì)erastin（脂質(zhì)ROS和鐵死亡誘導(dǎo)劑）和Fer-1（脂質(zhì)ROS和鐵死亡抑制劑）處理的肝細(xì)胞癌(HCC)HepG2細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行了RNA-seq和蛋白質(zhì)組學(xué)研究，獲得了6個(gè)可能與脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生和鐵死亡有關(guān)的候選分子（圖1A）。在沉默 RB1CC1后，HepG2細(xì)胞對(duì)由erastin 和RSL3（鐵死亡誘導(dǎo)劑） 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡變得不敏感（圖 1B）。

作者接下來評(píng)估了 RB1CC1 在一系列用 RSL3 和erastin 處理的癌細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) RB1CC1 在多種癌細(xì)胞系中表達(dá)增加且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的上調(diào)（圖 1C-D）。RB1CC1敲除使HepG2細(xì)胞對(duì)鐵死亡脫敏，RB1CC1過表達(dá)導(dǎo)致脂質(zhì)ROS的增加（圖 1E-F）。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明，RB1CC1與腫瘤細(xì)胞中的鐵死亡相關(guān)。

構(gòu)建IKE處理后的Rb1CC1–/–、Rb1CC1+/-和WT小鼠模型（圖 1G-I），進(jìn)一步證明鐵死亡相關(guān)的脂質(zhì)過氧化是RB1CC1依賴性的。RB1CC1敲除導(dǎo)致了CDX的生長(zhǎng)加速。此外，RB1CC1敲除組的IKE并不像對(duì)照組那樣抑制腫瘤生長(zhǎng)并誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化（圖 1J-L）。

這些發(fā)現(xiàn)共同支持 RB1CC1 可能參與鐵死亡的信號(hào)調(diào)節(jié)。

圖1 | RB1CC1使腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感

核易位的RB1CC1作為一種鐵死亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子

為了探究RB1CC1 如何參與鐵死亡的信號(hào)調(diào)節(jié)，通過RB1CC1 敲除/過表達(dá)發(fā)現(xiàn)可以減輕/增強(qiáng)RB1 mRNA 表達(dá)（圖 2A），隨后通過ChIP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) RB1CC1 被募集到用RSL3和erastin處理細(xì)胞中的 RB1 啟動(dòng)子中的 RB1CC1 結(jié)合區(qū) (RBR)（圖 2B），表明 RB1CC1 可能作為轉(zhuǎn)錄因子，在觸發(fā)鐵死亡時(shí)增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。

通過檢測(cè)在鐵死亡誘導(dǎo)后RB1CC1的細(xì)胞定位以及細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) RB1CC1在觸發(fā)鐵死亡后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中（圖 2C-D）。其中，RB1CC1中的499-548位氨基酸區(qū)域?qū)τ阼F死亡誘導(dǎo)的RB1CC1核易位至關(guān)重要（圖 2E）。

通過磷酸化蛋白凝膠檢測(cè)，RB1CC1在499-548位氨基酸區(qū)域，S537A突變能消除了RSL3和erastin治療后RB1CC1的超移（圖 2F-H），細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞死亡檢測(cè)也均表明RB1CC1在S537殘基處以鐵死亡依賴的方式被磷酸化（圖 2I-J）。

以上證明RB1CC1的鐵死亡誘導(dǎo)的核易位與S537殘基的磷酸化有關(guān)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的鐵死亡敏感至關(guān)重要。

圖2 | RB1CC1的核易位使細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感

RB1CC1涉及H4K12Ac組蛋白修飾在刺激增強(qiáng)子依賴性轉(zhuǎn)錄中的新作用

為了探討rb1cc1在鐵死亡觸發(fā)后的轉(zhuǎn)錄活性的機(jī)制，IP實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行蛋白鑒定，組蛋白H4被鑒定為RSL3/erastin誘導(dǎo)的rb1cc1相關(guān)蛋白（圖 3A）。組蛋白乙酰化與轉(zhuǎn)錄重編程密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)位于RB1啟動(dòng)子內(nèi)的RBR周圍的H4K12Ac水平以鐵死亡和RB1CC1依賴的方式升高（圖 3B）。

隨后，在HepG2細(xì)胞中使用抗rb1cc1和抗h4k12ac抗體進(jìn)行ChIP-Seq，發(fā)現(xiàn)RB1CC1占據(jù)了5個(gè)新的峰，被實(shí)驗(yàn)證實(shí)與RSL3和erastin有關(guān)，并伴隨著H4K12Ac組蛋白修飾的顯著增加（圖 3C-E）。通過基序分析和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，表明鐵死亡誘導(dǎo)的增強(qiáng)子活性可能依賴于RB1CC1與FOX基序的相互作用（圖 3F-G）。

根據(jù)RNA-seq結(jié)果，RSL3處理后SEC3、CYTH3、MEPCE、CYREN、CHCHD3、TPD52、SLC25A32、MYC和VRK3表達(dá)上調(diào)，是潛在的鐵死亡相關(guān)基因（圖 3H）。通過3C實(shí)驗(yàn)確定了RB1cc1相關(guān)增強(qiáng)子和鐵死亡相關(guān)基因啟動(dòng)子之間的相互作用（圖 3I-J）。

這些結(jié)果揭示了增強(qiáng)子結(jié)合對(duì)于RB1CC1刺激鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)至關(guān)重要。

圖3 | RB1CC1與H4K12Ac連接，介導(dǎo)鐵死亡相關(guān)和增強(qiáng)子依賴的轉(zhuǎn)錄

RB1CC1通過其靶基因調(diào)節(jié)線粒體和鐵死亡

通過對(duì)轉(zhuǎn)錄和蛋白組數(shù)據(jù)整合以及對(duì)線粒體ROS檢測(cè)，RB1CC1可能通過其靶基因CHCHD3以線粒體依賴的方式使細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感（圖 4A-C）。在缺乏線粒體DNA的細(xì)胞系中過表達(dá)CHCHD3，發(fā)現(xiàn)線粒體至少是RB1CC1和CHCHD3對(duì)鐵死亡敏感的關(guān)鍵（圖 4D-F）。

根據(jù)MMP和細(xì)胞死亡檢測(cè)，RSL3和erastin處理后，CHCHD3敲除使RB1CC1對(duì)MMP的刺激無效（圖 4G-J）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，IKE誘導(dǎo)的Chchd3表達(dá)是Rb1cc1依賴的，同時(shí)，Rb1cc1對(duì)于RSL3和erastin誘導(dǎo)的Chchd3的上調(diào)是不可或缺的（圖 4K-M）。

這些結(jié)果表明，CHCHD3作為RB1CC1的下游效應(yīng)分子，決定了線粒體功能和鐵死亡。

圖4 | RB1CC1靶基因與線粒體相關(guān)

ELP3與RB1CC1相互作用，調(diào)節(jié)H4K12Ac組蛋白修飾和鐵死亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄程序

通過蛋白組學(xué)檢測(cè)尋找rb1cc1相關(guān)的組蛋白調(diào)節(jié)因子，鎖定RSL3和erastin均可誘導(dǎo)的EPL3蛋白為相關(guān)因子（圖 5A）。ChIP和Re-ChIP實(shí)驗(yàn)表明，RSL3和erastin處理后，兩種與線粒體相關(guān)RB1CC1靶基因CHCHD3和SLC25A32通過ELP3誘導(dǎo)表達(dá)（圖 5B-E）。

通過3C實(shí)驗(yàn)和ChIP檢測(cè)，在ELP3敲除細(xì)胞中，ELP3對(duì)于SLC25A32和CHCHD3這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的關(guān)聯(lián)是不可或缺的（圖 5F-G）。這表明ELP3對(duì)RB1CC1刺激鐵死亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄重編程至關(guān)重要。細(xì)胞共定位和細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RB1CC1和ELP3依賴C端相互作用，對(duì)于使腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感至關(guān)重要（圖 5H-J）。

圖5 | ELP3對(duì)于RB1CC1介導(dǎo)的鐵死亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄重編程至關(guān)重要

JNK激活刺激RB1CC1使鐵死亡敏感并抑制腫瘤發(fā)生

使用多種藥物處理對(duì)鐵死亡的敏感性低的A549細(xì)胞，確定了PTX、Cllolar、OXA和TMZ這四種可協(xié)同誘導(dǎo)RB1CC1核易位的藥物（圖 6A-D）。通過亞細(xì)胞定位和磷酸化蛋白凝膠檢測(cè)，這四種藥物均可磷酸化和激活JNK，使用JNK抑制劑可阻止JNK和RB1CC1的磷酸化，而RB1CC1的磷酸化對(duì)其核易位至關(guān)重要（圖 6E-G）。這表明JNK激活物傾向于增強(qiáng)RB1CC1的磷酸化及其核易位。

ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，JNK抑制劑阻止了RSL3-和erastin誘導(dǎo)的RB1CC1和ELP3的富集和H4K12Ac的升高，CHCHD3增強(qiáng)子-啟動(dòng)子關(guān)聯(lián)也被消除，CHCHD3和RB1 mRNA也觀察到類似的結(jié)果（圖 6H-I）。JNK抑制劑可減輕RSL3和erastin誘導(dǎo)的MMP、mitoROS的生成和細(xì)胞死亡（圖 6J）。IKE與PTX、Cllolar、OXA和TMZ共同給藥可抑制腫瘤生長(zhǎng)（圖 6K）。

圖6 | JNK的激活增強(qiáng)了RB1CC1對(duì)鐵死亡敏感的作用

本研究的臨床和轉(zhuǎn)化意義

組織樣品芯片檢測(cè)和免疫組化分析，RB1CC1在肺癌隊(duì)列中也表達(dá)上調(diào)（圖 7A-B）。根據(jù)RB1CC1的細(xì)胞定位，將肺癌樣本分為細(xì)胞質(zhì)亞型、核亞型和質(zhì)/核亞型，免疫組化分析顯示細(xì)胞核亞型的4-HNE水平最高（圖 7C-E）。大部分檢測(cè)的肺癌樣本為RB1CC1核定位，核定位的原代LUSC細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性也較高（圖 7F-G）。

作者發(fā)現(xiàn)DEN/ccl4在WT和RB1CC1+/-小鼠肝癌模型中誘導(dǎo)肝腫瘤發(fā)生的能力相似（圖 7H-I）。在RB1CC1+/-小鼠中，IKE對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用顯著降低，生存結(jié)果也受到了影響（圖 7J-K）。

總之，RB1CC1對(duì)于基于鐵死亡的抗腫瘤治療的療效至關(guān)重要。

圖7 本研究的臨床和轉(zhuǎn)化意義

文章結(jié)論

(1)RB1CC1的核易位使腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感；

(2)JNK在S537位點(diǎn)的磷酸化是RB1CC1易位到細(xì)胞核的先決條件；

(3)RB1CC1招募ELP3來增強(qiáng)鐵死亡相關(guān)增強(qiáng)子中的H4K12Ac，而RB1CC1激活轉(zhuǎn)錄重編程以增強(qiáng)線粒體功能；

(4)RB1CC1是基于鐵死亡的抗腫瘤治療中不可或缺的靶點(diǎn)。

歡迎百度搜索歐易生物——訪問歐易生物官網(wǎng)——了解轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)

猜你想看

1、項(xiàng)目文章 | 歐易空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序助力解析青春期大鼠弓狀核的空間基因表達(dá)特征

2、項(xiàng)目文章 | 歐易生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序教你如何挖掘lncRNA數(shù)據(jù)！

3、項(xiàng)目文章 歐易單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+V(D)J測(cè)序助力解析Kdm6b調(diào)節(jié)腸道上皮內(nèi)TCRαβ+CD8αα+淋巴細(xì)胞成熟和細(xì)胞毒性的機(jī)制

4、項(xiàng)目文章 | 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)合腸道微生物測(cè)序解析人結(jié)腸不同部位免疫微環(huán)境的差異

End本文系歐易生物原創(chuàng)