前言

炭疽病菌于1882年由Penzig首次發(fā)現(xiàn)，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)。作為一種植物病原體，它可以引起多種木本和草本植物病害。嚴重制約了作物質(zhì)量和產(chǎn)量的提高，造成了巨大的經(jīng)濟損失，油茶樹種作為重要的木本油樹種，受炭疽病影響，油茶樹種子年產(chǎn)量減少20%-40%，嚴重者甚至減少80%，給當?shù)亓謩?wù)員和油茶樹企業(yè)造成重大損失。因此，挖掘抗病基因培育抗病品種是防治炭疽病最經(jīng)濟有效的措施。

2022年11月，由中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所姚小華、卓仁英研究員課題組在Frontiers in Plant Science期刊（IF:6.627）發(fā)表了題為 “Overexpression of dihydroflavonol 4-reductase boosts flavonoid production involved in the anthracnose resistance?”的研究成果，通過靶向代謝組學研究方法，發(fā)現(xiàn)了CoDFR在植物炭疽病抗性中特征，為類黃酮介導(dǎo)的防御機制的關(guān)鍵作用提供了理論依據(jù)。

中文標題：二氫黃酮醇4-還原酶（CoDFR）的過表達促進炭疽病抗性中黃酮的產(chǎn)生

研究對象：油茶

發(fā)表期刊：Frontiers in Plant Science

影響因子：6.627

發(fā)表時間：2022年11月

合作單位：中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所

運用生物技術(shù)：靶向代謝組學

研究思路

研究方法

1. 研究材料/實驗分組

(1) 培育油茶'CL150'（抗性系）和'CL102'（感敏系）2年生扦插苗

(2)?共4個處理組（CL150CK、CL150T、CL102CK和CL102T），每個處理組每個時間點重復(fù)3個生物學重復(fù)。

2.研究方法

（1）實時熒光定量 PCR （qRT-PCR） 分析

（2）亞細胞定位和過表達分析

（3）靶向代謝組分析：UPLC–質(zhì)譜/質(zhì)譜分析

研究結(jié)果

1.光孢子蟲感染后油茶葉片生理特性的變化

為探究光孢子蟲感染過程中油茶葉片的生理反應(yīng)，本研究在12、24、48、72、96和120 hpi采集的不同樣品中測定了MDA含量，測定了CAT、POD和SOD活性?？傮w而言，CL102T（接種CL102）中的MDA含量顯著高于CL150T（接種的CL150）（P<0.05）（表S2;圖1A）。耐油茶和易感品系的CAT活性增加。其中，CL102T在72 hpi時達到215.01U?g，明顯高于CL102CK。CL150T在72 hpi時達到356.22U?g，明顯高于CL150CK（表S2）。發(fā)現(xiàn)CL150T中的CAT活性高于CL102T，CL150CK和CL102CK中的CAT活性，并且在整個實驗過程中略有變化（圖1B）。在12 hpi時，CL102T和CL150T中的POD活性顯著高于CL102CK和CL150CK（表S2;圖 1C）。在48 hpi時，CL150T的POD活性最高（29.67U?g），顯著高于CL102T（26.91U?g）。在CL150T和CL102T中，POD活性的最大值為48 hpi，48 hpi后下降。

在所有時間點，CL150T中的POD活性都高于CL102T（圖1C）。在72 hpi時，CL150T葉片SOD活性達到94.53U?g的峰值，顯著高于CL150CK的活性。CL102T在72 hpi時SOD活性達到峰值72.25U?g，CL150T葉片SOD活性是CL102T的1.34倍。CL150T中的SOD活性顯著高于CL102T（表S2;圖 1D）。

圖1 | 測量不同時間點的生理指標

2.油茶抗病易感系黃酮含量估算

為了確定類黃酮在抗性和敏感性系中的積累，作者以3dpi測量了油茶葉片中的類黃酮含量。CL150T中的黃酮含量為54.51 mg/g，CL102T中的黃酮含量為47.54 mg/g。CL150T中原花青素B1、原花青素B2和原花青素B3的含量分別為204.49、54.68和107.22μg/g，而CL102T中的這些值分別為86.21、9.31和36.59μg/g（表1）。CL150T中TF、TP、原花青素B2和原花青素B3含量顯著高于CL150CK。相比之下，CL150T中原花青素B1的含量低于CL150CK中。

表1 | 不同處理的黃酮含量

3.耐藥油茶CoDFR的分離和序列分析

CoDFR的全長CDS序列為1044 bp，編碼347個氨基酸（圖2A）。為了進一步探索CoDFR的進化關(guān)系，運用不同植物物種的DFR氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，CoDFR序列與切基安戈萊奧薩的DFR具有最高的同源性（~79%）（圖2B）。

圖2 | （A）CoDFR的CDS和氨基酸序列；（B）CoDFR的系統(tǒng)發(fā)育樹分析；

4.CoDFR基因在耐藥油茶中的組織特異性表達模式

CoDFR的表達從0逐漸增加到96 hpi，并且明顯高于對照組（0 hpi）（圖3A）。同時，對不同油茶組織中CoDFR的表達（圖3B），發(fā)現(xiàn)CoDFR在葉芽中的表達水平明顯高于葉、莖和根。

圖3?|?CoDFR基因在耐藥油茶中的組織特異性表達模式

（A）?CoDFR?在果糖衣原體感染期間不同時間點的相對表達分析

（B） CoDFR 在抗病系中的組織特異性表達分析。

誤差線表示來自三個生物重復(fù)±SD?！?”表示與WT的顯著差異（p<0.05），“***”表示與WT的顯著差異（p<0.005）。

5.?CoDFR的亞細胞定位

CoDFR蛋白定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）由亞細胞定位預(yù)測網(wǎng)站:在線預(yù)測。

為了確定CoDFR的亞細胞定位，將含有CoDFR：GFP（綠色熒光蛋白）融合構(gòu)建體的根癌曲霉細胞懸浮液注射到煙葉中。如圖4A所示，控制RFP（mCherry的紅色熒光蛋白）信號分布在ER和細胞膜中，游離GFP信號出現(xiàn)在細胞核，細胞膜和細胞質(zhì)中，信號分散在整個細胞中。同時，ER標志物和CoDFR-GFP共定位在ER和細胞膜中（圖4B），表明CoDFR在ER中發(fā)揮其功能。

圖4?| CoDFR的亞細胞定位

（A）對照，EV-GFP和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標志物（35S：EV-GFP）；

（B）CoDFR，35S：CoDFR-GFP和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)制造者融合蛋白（35S：CoDFR-GFP）；

白色箭頭顯示描述的位置

6.識別過度表達的煙草株系

為了揭示CoDFR的功能，通過CoDFR的異源表達產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因煙草系。在潮霉素選擇培養(yǎng)基上篩選13個獨立的轉(zhuǎn)基因煙草系，并通過qRT-PCR分析測定所有株系中CoDFR的相對表達水平。根據(jù)結(jié)果，選擇了三個CoDFR表達較高的轉(zhuǎn)基因系（D4，D11和D12系）進行后續(xù)分析（圖5A）。為了評估轉(zhuǎn)基因煙草是否具有更高的抗病性，用炭疽病菌接種了五周齡的煙草葉片。有趣的是，在轉(zhuǎn)基因葉上觀察到輕微的壞死病變，與接種后4天野生型（WT）葉上出現(xiàn)的嚴重疾病癥狀形成鮮明對比（圖5B）。

圖5?| 識別過度表達的煙草株系

（A）CoDFR在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的相對表達水平，紅框表示相對表達較高的3個轉(zhuǎn)基因煙草系。

（B）果果菌感染后轉(zhuǎn)基因煙草的表型，比例尺為0.5厘米。

7.煙草中CoDFR的過表達增強了對炭疽病感染的抵抗力

轉(zhuǎn)基因煙草上的疾病斑點明顯小于WT上的疾病斑點（圖6A）。為了進一步研究CoDFR的過表達是否促成了黃酮類化合物的積累，作者首先估算了轉(zhuǎn)基因煙葉中的黃酮含量。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因D4，D11和D12系中的類黃酮含量顯著高于對照（WT），分別增加了3.89，4.07和4.24倍（圖6B）。

此外，作者評估了黃酮生物合成途徑基因在96 hpi下感染果糖梭菌的轉(zhuǎn)基因煙葉中的表達。結(jié)果表明，在CoDFR過表達的煙葉中，參與類黃酮途徑的所有基因的表達均發(fā)生改變。NtCHS上調(diào)了2.38倍、2.74倍和4.24倍;NtCHI在D4、D11和D12中分別上調(diào)了5.01、2.54和3.08倍。NtF3'H、NtF3'5'H、NtF3H、NtDFR、NtLAR和NtFLS的表達倍數(shù)變化分別為0.34-1.83、3.76-4.29、1.00-4.71、5.61-8.26、1.24-4.65和0.68-1.04。NtANS、NtANR和NtGT表達分別增加了5.65~6.47、6.21~8.56和1.99~4.09倍（圖6C）。

圖6 | CoDFR的過表達增強了對炭疽病感染的抵抗力

（A）果果孢桿菌感染后疾病斑點大小的統(tǒng)計分析；

（B）轉(zhuǎn)基因煙草中的黃酮含量；

（C）參與類黃酮生物合成途徑的關(guān)鍵基因的表達水平；

星號表示與WT的統(tǒng)計學顯著差異（“*”P < 0.05）；

8.CoDFR過表達促進了煙草中黃酮類化合物的積累

為了探索過表達系中類黃酮物質(zhì)積累的變化，研究使用UPLC-ESI-MS/MS靶向代謝組學研究對130多種類黃酮進行了絕對定量。在野生型和CoDFR過表達系（D4、D11和D12系的等量混合）中共鑒定出65個黃酮類化合物，其中31個上調(diào)，12個下調(diào)，22個不變（差異倍數(shù)為≧2或≦0.5作為篩選標準。詳情見表S3）。此外，46種類黃酮衍生物在CoDFR過表達系中的積累更高（圖7A;表 S2）。與對照組相比，山奈酚、槲皮素、槲皮素、柚皮苷、根皮苷和槲皮素-3-半乳糖苷等主要類黃酮的水平同時增加了14.82倍、8.24倍、6.82倍、2.03倍、5.83倍和1.52倍（圖7B;表 S3）。有趣的是，過表達系的水楊酸較高，但水楊素含量低于WT（圖7C）。

圖7?| 靶向代謝組學研究煙草中黃酮類化合物變化

（A） 65 種類黃酮的熱圖可視化。每種黃酮的含量按行歸一化；

（B）?表達CoDFR的煙草中不同黃酮類化合物的含量；

（C）?表達CoDFR的煙草中的水楊酸含量；

“*”表示與WT有統(tǒng)計學意義的差異（P < 0.05）。

研究結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)接種后感病油茶葉片黃酮含量增加。抗性油茶樹品種的CoDFR的表達與光孢子蟲侵染的時間進程呈正相關(guān)。煙草中CoDFR的過表達增加了水楊酸含量，調(diào)節(jié)了黃酮通路相關(guān)基因的表達，促進了黃酮的積累，從而增加了炭疽病的抵抗力。

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本文運用經(jīng)典的黃酮酚類靶向代謝組學研究方法發(fā)現(xiàn)CoDFR的過表達可能與增加油茶對真菌病原體的抵抗力有關(guān)。這為植物對真菌等的廣泛抗性提供了參考。

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