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布小谷推薦的這篇文章，研究?jī)?nèi)容具有較高的創(chuàng)新點(diǎn)（化療耐藥）（ps：內(nèi)容選的好，很容易達(dá)到出其不意的效果哦），研究思路亮眼，結(jié)合單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析，并且又有大量外部數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證，而且再加上外部實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（PCR+WB+CCK-8）。整個(gè)文章數(shù)據(jù)量不僅大而且創(chuàng)新性很高，5+的文章手到擒來(lái)?。╬s：還沒(méi)有思路嗎？還在為創(chuàng)新點(diǎn)苦思冥想嗎？快來(lái)找生信鳥(niǎo)吧！）

l題目：通過(guò)綜合分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證胰腺癌化療耐藥相關(guān)預(yù)后基因特征的鑒定

l雜志：Frontiers in Oncology

l影響因子：IF=5.738

l發(fā)表時(shí)間：2023年5月

研究背景

化療耐藥是改善胰腺癌(PC)預(yù)后的主要障礙?；熌退幨嵌嘁蛩氐?，是胰腺癌細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境相互作用的結(jié)果。然而，更多的胰腺癌患者將受益于精準(zhǔn)治療和靶向藥物。因此尋找新的無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)志物對(duì)于PC患者早期診斷和及時(shí)治療是非常必要的。

數(shù)據(jù)來(lái)源

研究思路

根據(jù)來(lái)自Cancer Therapeutics Response Portal (CTRP v2)的吉西他濱敏感性數(shù)據(jù)，共有30個(gè)PC細(xì)胞系被分型。隨后鑒定了吉西他濱耐藥細(xì)胞和吉西他濱敏感細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因(DEGs)。這些與預(yù)后價(jià)值相關(guān)的上調(diào)DEGs被納入癌癥基因組圖譜(TCGA)隊(duì)列的LASSO Cox風(fēng)險(xiǎn)模型。來(lái)自GEO的4個(gè)數(shù)據(jù)集(GSE28735、GSE62452、GSE85916和GSE102238)被用作外部驗(yàn)證隊(duì)列。然后，根據(jù)獨(dú)立的預(yù)后因素制定nomogram。采用“oncoPredict”方法評(píng)估多種抗PC化療藥物的療效。使用“tcgabiollinks”包計(jì)算腫瘤突變負(fù)荷(TMB)。使用“IOBR”包進(jìn)行腫瘤微環(huán)境(TME)分析，使用TIDE和“easy”算法評(píng)估免疫治療效果。最后通過(guò)RT-qPCR、Western blot和CCK-8檢測(cè)驗(yàn)證ALDH3B1和NCEH1的表達(dá)和功能。

主要結(jié)果

1.耐吉西他濱PC細(xì)胞系中DEGs上調(diào)

對(duì)CTRP數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行Z-評(píng)分。由于在7個(gè)細(xì)胞系(PANC0403、PATU8988S、PANC0813、PANC1、CAPAN1、MIAPACA2和SUIT2)中觀察到類似的反應(yīng)，因此選擇0.5和-0.5作為分組閾值。在30個(gè)PC細(xì)胞系中，13個(gè)被分類為吉西他濱耐藥，7個(gè)被分類為中度吉西他濱耐藥，10個(gè)被分類為吉西他濱敏感(圖1A)。差異表達(dá)分析顯示，17個(gè)基因在吉西他濱耐藥組的表達(dá)水平明顯高于吉西他濱敏感組(圖1B, C)。

2.?通過(guò)RNA-seq和scRNA-seq檢測(cè)吉西他濱化療耐藥相關(guān)預(yù)后基因的表達(dá)水平

通過(guò)K-M分析得出，與吉西他濱化療耐藥相關(guān)的17個(gè)DEGs中有6個(gè)在TCGA隊(duì)列中具有預(yù)后價(jià)值，其中ALDH3B1和NCEH1的生存曲線如圖2A。（ps：生存分析也可以用布小谷推薦的零代碼生信分析小工具實(shí)現(xiàn)，云生信分析工具平臺(tái)包含超多零代碼分析和繪圖小工具，上傳數(shù)據(jù)就而已自動(dòng)出圖，感興趣的小伙伴歡迎來(lái)嘗試喲，網(wǎng)址：http://www.biocloudservice.com/home.html）6種預(yù)后DEGs在TCGA腫瘤樣本中的表達(dá)水平明顯高于未匹配GTEx正常樣本(圖2B)。一致地，這些基因在耐吉西他濱的PC細(xì)胞系中比在正常胰腺細(xì)胞系中表達(dá)得更高(圖2C)。然而，匹配的腫瘤組織與正常組織比較表明，EGFR在惡性組織中沒(méi)有相對(duì)上調(diào)(圖2D-F)。

經(jīng)質(zhì)控，GSE212966正常/腫瘤細(xì)胞數(shù)為10751/17338,CRA00160正常/腫瘤細(xì)胞數(shù)為13771/34974。在單細(xì)胞水平上，與ALDH3B1、EGFR、ERAP2、MSLN和NCEH1相比，腫瘤細(xì)胞表達(dá)CHST11水平較低(圖3A-E、4A-E)。如UMAP圖所示，大多數(shù)星狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞來(lái)自腫瘤樣本(圖3A-C, 4A-C)。單細(xì)胞分析進(jìn)一步證實(shí)了大量RNA-seq分析中EGFR的相對(duì)低表達(dá)(圖3D, 4D)。然而，在腫瘤組織的惡性成分和間質(zhì)成分中，它仍然是上調(diào)的，這證明了它對(duì)腫瘤的進(jìn)展是不可或缺的(圖3E, 4E)。與CRA00160的結(jié)果相比，GSE212966中ERAP2的平均UMI計(jì)數(shù)在腫瘤樣本中較低，這可能是由于檢測(cè)到的惡性細(xì)胞比例較低(圖3A-D)。（ps：這里就凸顯了作者分析思路的邏輯性與創(chuàng)新性、通過(guò)RNA-seq和scRNA-seq檢測(cè)吉西他濱化療耐藥相關(guān)預(yù)后基因的表達(dá)水平，大量數(shù)據(jù)集進(jìn)行探究，文章質(zhì)量瞬間提升，感興趣的小伙伴歡迎借鑒復(fù)現(xiàn)呦?。?/span>

3.?化學(xué)耐藥相關(guān)基因標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證

除CHST11外，其他5個(gè)化療耐藥相關(guān)基因均納入預(yù)測(cè)TCGA訓(xùn)練隊(duì)列OS的LASSO Cox模型(圖5A、B)，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式為:風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分= (0.3731 * EGFR表達(dá))+ (0.2364 * ERAP2表達(dá))+ (0.1588 * MSLN表達(dá))+ (0.1254 * NCEH1表達(dá))+ (0.2233 * ALDH3B1表達(dá))。根據(jù)TCGA隊(duì)列患者的中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將所有入組患者分為高危組和低危組。K-M分析和風(fēng)險(xiǎn)圖顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較高的患者預(yù)后明顯較差(圖5C、D)。TCGA、GEO和全隊(duì)列的Log-rank檢驗(yàn)P值均小于0.001。TCGA組的1年、3年和5年生存率預(yù)測(cè)精度分別為0.750/0.781/0.741,GEO組為0.596/0.615/0.755，全組為0.653/0.668/0.765(圖5E)。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與5個(gè)基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)(圖5F)。（ps：這里的驗(yàn)證樣本數(shù)量比較大，也是近期文章發(fā)高分的一個(gè)助力點(diǎn)，驗(yàn)證隊(duì)列較多，并且結(jié)合濕實(shí)驗(yàn)，是未來(lái)生信研究的一個(gè)趨勢(shì)）

4.?化學(xué)敏感性分析

由于5個(gè)預(yù)后基因在耐吉西他濱PC細(xì)胞系中高度表達(dá)，因此，這一已建立的基因標(biāo)記是一個(gè)非常有希望的PC患者吉西他濱敏感性指標(biāo)。后續(xù)分析結(jié)果顯示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分隨著吉西他濱耐藥評(píng)分的增加而增加，低風(fēng)險(xiǎn)組對(duì)吉西他濱更敏感(圖6A-D)。由于該基因標(biāo)記與吉西他濱敏感性密切相關(guān)，我們進(jìn)一步探索了其在預(yù)測(cè)其他常用抗PC藥物反應(yīng)方面的潛力。如圖6E所示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較高的患者更容易對(duì)阿霉素、奧拉帕尼、紫杉醇和FOLFRINOX成分(氟尿嘧啶、伊立替康、奧沙利鉑)產(chǎn)生耐藥。

5.?免疫浸潤(rùn)及免疫治療敏感性評(píng)價(jià)

綜合7種已發(fā)表的方法(CIBERSORT、MCPcounter、EPIC、xCell、quantiseq、TIMER及 ssGSEA算法)，綜合評(píng)價(jià)TCGA和GEO隊(duì)列中PC患者的TME組成。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與支持免疫抑制的細(xì)胞呈正相關(guān)，包括髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)和輔助T型2 (Th2)細(xì)胞(圖7A)。與此一致的是，高風(fēng)險(xiǎn)組的抗癌細(xì)胞，如CD8+ T細(xì)胞、細(xì)胞毒性細(xì)胞和效應(yīng)記憶T (Tem)細(xì)胞明顯較低(圖7B)。應(yīng)用TIDE方法估算ICB耐藥評(píng)分，結(jié)果顯示低危組對(duì)ICB治療更為敏感(圖7C)? ? ?

6. PC細(xì)胞功能喪失實(shí)驗(yàn)

RT-qPCR分析表明，ALDH3B1和NCEH1在三種PC細(xì)胞系(AsPC-1, CFPAC-1, 和PANC-1)中的表達(dá)水平相對(duì)高于正常胰腺上皮細(xì)胞系(hTERT-HPNE)(圖8A, C)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí), siRNA的沉默效率較高(圖8B, D)。CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)顯示，敲除ALDH3B1和NCEH1后，PC細(xì)胞株的增殖率明顯降低(圖8E)。吉西他濱細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，敲低ALDH3B1和NCEH1增強(qiáng)了吉西他濱的敏感性(圖8F)。值得注意的是，這種效應(yīng)是濃度依賴的。CFPAC-1/AsPC-1/PANC1細(xì)胞活力差異的濃度閾值為0.01/0.1/10。這些發(fā)現(xiàn)表明，NCEH1和ALDH3B1是PC細(xì)胞增殖和吉西他濱敏感性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。（ps：這里就用濕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，用正常胰腺上皮細(xì)胞系和三株胰腺癌細(xì)胞系進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證兩個(gè)預(yù)后基因的表達(dá)。通過(guò)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，敲低兩個(gè)預(yù)后基因的表達(dá)量，進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和藥物敏感性實(shí)驗(yàn)的探究，是文章的又一亮點(diǎn)，感興趣的小伙伴可以進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)哦！

文章小結(jié)

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