免疫細胞相關(guān)生信還有什么新的切入點嗎？

我關(guān)注的疾病CAF、TAM、T細胞都有人做了，還能做啥呢？

免疫細胞那么多，還有B細胞、NK細胞、MDSC都可以考慮呀，T細胞還有很多亞型也可以試試，創(chuàng)新性都很不錯哦！

今天我們來聊聊NK 細胞，它們的數(shù)量在人體循環(huán)淋巴細胞中占比 5-20%！NK 細胞和T細胞一樣，都具有殺傷癌細胞、感染病毒細胞等病原體的能力，在我們的免疫系統(tǒng)中扮演著非常關(guān)鍵的角色。

話說現(xiàn)在NK細胞免疫療法相當火熱了，但基本上都是在做臨床和基礎(chǔ)實驗，可還有很多小伙伴沒有實驗條件或者急需文章，不怕，這時候就該請出咱們“生信”大佬出手啦！

目前利用NK細胞相關(guān)基因特征做生信暫時還比較少，那么這波入手NK細胞生信絕對是個良機~

（不知道如何找新思路或創(chuàng)新升級的可以找小云，各種個性化分析思路等你來挑~）

那么NK細胞怎么做生信？首先要拿到NK細胞相關(guān)的基因集合，有幾種方法，比如數(shù)據(jù)庫下載、文獻整理、免疫浸潤+WGCNA以及單細胞數(shù)據(jù)分析等等。 ?

小云今天就分享一個利用單細胞數(shù)據(jù)分析獲取NK細胞相關(guān)基因的思路，疾病分型+經(jīng)典預(yù)后模型構(gòu)建套路，用上NK細胞基因特征就可以輕松拿下6分+純生信，超高性價比，一起來看看吧！

題目：揭示以自然殺傷細胞為主的免疫異質(zhì)性對肝細胞癌的預(yù)后和治療意義

雜志：Computers in biology and medicine

影響因子：6.698

發(fā)表時間：2023年4月

研究思路

利用TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集進行了單細胞RNA測序(scRNA-seq)分析，以鑒定NK細胞標記基因(NKGs)，并發(fā)現(xiàn)了80個與預(yù)后相關(guān)的基因?；陬A(yù)后NKGs, HCC患者被分為兩種不同臨床結(jié)果的亞型。隨后，對預(yù)后NKGs進行了LASSO-COX和逐步回歸分析，以建立5個基因的預(yù)后特征- NKscore。綜合描述了NKscore分層的兩個危險組的不同突變狀態(tài)。此外，所建立的NKscore相關(guān)nomogram具有較強的預(yù)測性能。通過單樣本基因集富集分析(ssGSEA)揭示腫瘤免疫微環(huán)境(TIME)的情況。T細胞受體(TCR)庫、腫瘤炎癥特征(TIS)和免疫表型(IPS)分析揭示了兩個NKscore風險組之間免疫治療敏感性的差異。

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主要研究結(jié)果

1.?利用單細胞數(shù)據(jù)（scRNA-seq）數(shù)據(jù)鑒定HCC中的NK細胞標記基因（NKGs）

分析scRNA-seq數(shù)據(jù)集評價HCC-TME中細胞亞群的多樣性。利用全局標度歸一化方法LogNormalize對每個細胞的mRNA表達進行歸一化，然后進行高變量基因的鑒定。使用“clustree”函數(shù)確定了合適的聚類值(圖1A)。參考CellMarker數(shù)據(jù)庫將細胞標注并分類為惡性細胞、內(nèi)皮細胞、NK細胞、T細胞、髓細胞源性細胞等(圖1B)。熱圖顯示了前四個標記基因在不同細胞類型中的平均表達水平(圖1C)。tSNE圖還顯示了NK細胞中排名前四位的標記基因的表達水平(圖1D)。通過將“FindAllMarkers”函數(shù)整合到“Seurat”中，獲得265個NK細胞標記基因。

（ps：單細胞分析可以用小云新開發(fā)的零代碼生信分析小工具實現(xiàn)，云生信分析工具平臺包含超多零代碼分析和繪圖小工具，上傳數(shù)據(jù)一鍵出圖，感興趣的小伙伴歡迎來嘗試喲，網(wǎng)址：http://www.biocloudservice.com/home.html?）。

圖1.?scRNA-seq分析用于鑒定NK細胞標記基因(NKGs)

2.?聚類分析：根據(jù)預(yù)后NKGs識別出兩種NK亞型

作者采用“multi-split”方法篩選了80個與預(yù)后顯著相關(guān)的NKGs，隨后通過共識聚類方法將其用于識別兩種HCC亞型。圖2D的熱圖顯示了80個NKGs在兩種NK亞型HCC患者中的表達，并標注了多種臨床特征(腫瘤負擔、分期、分級、BMI、種族、性別和年齡)。3D-PCA圖顯示了兩種亞型HCC之間的差異(圖2E)。兩種NK亞型在OS、DFS、PFS和DSS方面存在明顯差異，亞型2患者的生存結(jié)局比亞型1更差(圖2F-I)。

圖2.?預(yù)后NKGs的鑒定和共識聚類

3.?肝癌NK亞型的臨床意義及生物學(xué)功能

作者分析了兩種亞型HCC患者中多種臨床特征的比例，亞型2的晚期患者比例明顯更高 (圖3A)。然后篩選兩種亞型之間的DEGs，對DEGs進行GO和KEGG富集分析，富集項大多與免疫相關(guān)(如T細胞激活、Th17細胞分化等)，表明兩種亞型之間免疫微環(huán)境的差異(圖3B和C)。接著進行GSVA和GSEA分析，結(jié)果顯示，在亞型1的TME中，干擾素等多個炎癥相關(guān)通路顯著富集 (圖3D和E)。

圖3.?肝細胞癌NK模式的臨床意義及分子特征

4.?兩種NK亞型均表現(xiàn)出不同的TME特征

作者使用ESTIMATE算法計算了ImmuneScore、StromalScore、ESTIMATEScore和TumorPurity，發(fā)現(xiàn)亞型1的間質(zhì)和免疫細胞浸潤明顯增高，腫瘤純度較低，提示亞型1的HCC患者TIME狀態(tài)呈陽性，預(yù)后較好(圖4A-D)。亞型1顯示出相對較高的TIP評分(圖4E)。此外，亞型1患者的細胞溶解評分較高（ps：細胞溶解評分是由顆粒酶A?(GZMA)和穿孔素1 (PRF1)的表達水平計算得出的指標，主要由效應(yīng)細胞毒性T細胞和NK細胞分泌）(圖4F)。

圖4. 肝癌NK亞型的免疫特征

5.?預(yù)后NK評分系統(tǒng)的構(gòu)建與評價

為了建立可靠準確的基于NKGs的預(yù)后預(yù)測工具，作者采用TCGA訓(xùn)練集，這5個NKGs中UBB、CIRBP、GZMH為保護基因，NUDC、NCL為危險基因（圖5A）。根據(jù)NKscore的中位值將HCC患者分為兩組不同危險程度的患者，PCA圖顯示兩組患者在轉(zhuǎn)錄組上存在明顯差異(圖5B)。HCC患者NKscore值的分布、OS狀態(tài)以及5個NKscore基因的表達譜如圖5C所示。Kaplan-Meier生存分析顯示低風險組患者OS狀態(tài)較好，tROC曲線顯示NKscore預(yù)測1、3、5年OS的準確性較高(圖5D、E)， PFS、DFS、DSS生存分析顯示低風險組患者預(yù)后較好(圖5F-H)。

圖5.?基于TCGA訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的HCC NK評分系統(tǒng)(NKscore)構(gòu)建與評估

而且NKscore優(yōu)于其他已發(fā)表的HCC特征和已知的生物標志物(圖6D-F)。分析證明了NKscore的穩(wěn)健性和準確性。

圖6.??NKscore與其他已發(fā)表的HCC特征/標志比較

6.?構(gòu)建nomogram?

基于NKscore、分期和腫瘤負荷，構(gòu)建了一個綜合預(yù)后nomogram來預(yù)測HCC患者的1-、3-和5年OS(圖7C)。校準曲線顯示，nomogram預(yù)測的3年和5年OS與觀測的OS之間具有良好的一致性(圖7D)。此外，nomogram診斷為高危的HCC患者臨床預(yù)后較差（圖7E），tROC曲線顯示nomogram在預(yù)測1年、3年和5年OS方面具有極好的準確性(圖7F)。nomogram與腫瘤負荷、分期及其組合相比，c指數(shù)也最高，表明其準確性最高(圖8G)。

圖7. 建立nomogram并評價

7.?NKscore與HCC的TIME特征顯著相關(guān)

采用ssGSEA分析HCC患者28種浸潤免疫細胞的分布(圖8A)。相關(guān)分析(圖8B)和差異分析(圖8C)分離出與NKscore相關(guān)的17種免疫細胞類型，其中15種重疊(圖8D)。接下來，作者對NKscore與多種免疫功能進行相關(guān)性分析。如所示，發(fā)現(xiàn)NKscore與細胞周期等幾種免疫治療預(yù)測通路呈顯著正相關(guān)（圖8E和F）。

圖8. NKscore與TME特征的相關(guān)性

8.?NKscore預(yù)測HCC的治療反應(yīng)

分析HCC患者的TCR庫，低NKscore風險組的TCR豐富度和多樣性明顯更高，表明他們具有更大的腫瘤免疫潛力(圖9A)。此外，低風險組患者的TIS評分明顯較高(圖9B)，免疫治療反應(yīng)的指標IPS在低NKscore風險組中也更高，表明低NKscore風險組的患者對免疫治療的反應(yīng)可能更好(圖9C)。

為了進一步研究NKscore是否可以更直接地預(yù)測免疫治療的反應(yīng)，作者將IMvigor210隊列分為NKscore高、低風險組，生存分析顯示低風險組患者的OS更好(圖9D)。IMvigor210隊列的SD/PD組和來自GSE126044的無應(yīng)答組具有更高的風險評分(圖9E-F)。此外，箱線圖顯示10種常見的化療/靶向治療藥物在兩個危險組中的效果不一致(圖10G)，提示NKscore在臨床應(yīng)用中對化療/靶向藥物的選擇具有潛力。

總結(jié)

這篇文章是利用單細胞數(shù)據(jù)分析獲得了NK細胞相關(guān)基因，然后基于NK細胞相關(guān)基因進行疾病分型+構(gòu)建風險預(yù)后模型，雖然整體內(nèi)容沒有脫離常規(guī)預(yù)后模型分析套路，但用上“NK細胞”這一切入點后，身價倍增，文章分數(shù)蹭蹭上漲，絲毫不遜色于前段時間比較火的CAF和TAM！并且相較于前2個方向，NK細胞目前的生信發(fā)文量還不多，屬于黃金搶發(fā)期，感興趣的小伙伴趕快分析起來吧。

如果你還苦惱于生信分析沒有思路，或者嫌分析方法太過簡單、太過老套，想要創(chuàng)新思路的，或者對NK細胞等熱點方向感興趣的小伙伴快來聯(lián)系小云吧！