期刊：Immunity

影響因子：31.428

導(dǎo)語

在自身免疫性疾病、慢性感染、移植排斥和癌癥中遭受慢性炎癥和抗原持久性的組織中發(fā)現(xiàn)了三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)?(TLS)。腫瘤內(nèi) TLS 的存在和密度與許多癌癥類型的良好預(yù)后相關(guān)。

TLS 是在成纖維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)上形成的有組織的淋巴樣聚集體，包括一個(gè) T 細(xì)胞區(qū)，其中成熟的樹突細(xì)胞與 T 細(xì)胞接觸，以及一個(gè)濾泡性 B 細(xì)胞區(qū)。在本篇文章中，解決了 TLS 作為 B 細(xì)胞原位成熟驅(qū)動(dòng)因素、產(chǎn)生抗體 PC 的作用以及它們對(duì) ICI 反應(yīng)的問題。研究了腫瘤的空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)原發(fā)性透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌 (ccRCC) 的微環(huán)境 (TME)。

科學(xué)問題

新鮮樣本空轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄組、石蠟樣本空間轉(zhuǎn)錄組、免疫組化技術(shù)、多重免疫熒光。

研究結(jié)果

1. 空間轉(zhuǎn)錄組揭示了TLS+ 腫瘤中富含 B 細(xì)胞的熱點(diǎn)區(qū)域

作者利用10X Genomics Visium 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì) 24 個(gè) ccRCC 原發(fā)性腫瘤（冷凍切片（n = 12）和 FFPE 切片（n = 12））進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ca9是ccRCC腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物，在大多數(shù)ccRCC腫瘤中的表達(dá)與23/24腫瘤中的表達(dá)一致，并且在腫瘤切片中分布均勻。使用微環(huán)境populations (MCP)-counter評(píng)估 TME 的免疫和基質(zhì)細(xì)胞群的分布，該counter從轉(zhuǎn)錄組譜估計(jì)細(xì)胞類型豐度。在下圖所示的 ?TLS+ 腫瘤中，B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞在TLS 區(qū)域中表達(dá) 。這些CD8 T細(xì)胞在腫瘤中低表達(dá)，在 TLS 區(qū)域略有富集。TLS 中的單核細(xì)胞分布較多，而 NK 細(xì)胞更廣泛地分布在整個(gè)腫瘤切片中。內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均勻分布，在 TLS 內(nèi)分布較少。但成纖維細(xì)胞在 TLS 區(qū)域內(nèi)分布較多。這些不同的 TME 空間組織模式在 8 個(gè) TLS+ 和 4 個(gè) TLS- ?冷凍切片腫瘤以及 10 個(gè) TLS+ 和 2 個(gè) TLS- FFPE 腫瘤中始終可以識(shí)別，這表明 TLS 與 B 細(xì)胞、T 細(xì)胞和成纖維細(xì)胞特征的表達(dá)有關(guān)。

2. Ig 和 B 細(xì)胞相關(guān)基因在 TLS中的顯著富集促使研究關(guān)注 B 細(xì)胞

通過對(duì)腫瘤區(qū)域和TLS區(qū)域的差異分析顯示，免疫細(xì)胞的基因表達(dá)和成纖維細(xì)胞基因表達(dá)組成了TLS區(qū)域的主要表達(dá)特征，Ig 和 B 細(xì)胞相關(guān)基因在 TLS 中的顯著富集促使研究關(guān)注 B 細(xì)胞。PC 相關(guān)基因 MZB1 的表達(dá)在 TLS 中高，而在冷凍切片腫瘤的腫瘤區(qū)域中總體低。由于 PC 的主要功能是產(chǎn)生抗體，于是分析了免疫球蛋白基因的空間表達(dá)。最終證實(shí)了成纖維細(xì)胞與 CXCL12、MZB1 與成纖維細(xì)胞以及 MZB1與 CXCL12 在距 TLS 一定距離處的共定位?？偨Y(jié)來說，在 TLS+ 腫瘤中，表達(dá)IGHG1 和 IGHA1的 PC 存在于 TLS 附近，并且可能隨成纖維細(xì)胞一起在腫瘤內(nèi)遷移。

3. 空間B細(xì)胞受體（BCR）分析可識(shí)別原位超突變和克隆選擇

TLS 中 B 細(xì)胞成熟亞型和 PC 的共定位暗示了原位 B 細(xì)胞適應(yīng)性免疫的產(chǎn)生。在此過程中，B 細(xì)胞會(huì)突變其 B細(xì)胞受體 (BCR) 序列，并選擇和擴(kuò)增最親和的克隆。所以作者研究了 BCR 的核苷酸序列。因?yàn)閂isium冰凍切片空間技術(shù)原理是基于芯片中不同spot點(diǎn)位上Bracode的RNA測(cè)序，這使得作者能夠查詢?cè)嫁D(zhuǎn)錄物并進(jìn)行空間BCR分析。作者結(jié)合bulk RNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)TLS具有大量單一的輕鏈克隆型，突變的V基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量較少，多數(shù)突變序列轉(zhuǎn)錄本位于TLS遠(yuǎn)端腫瘤區(qū)域。

4. TLS的漿細(xì)胞沿著成纖維細(xì)胞軌跡擴(kuò)散

為了分析腫瘤內(nèi) PCs 和成纖維細(xì)胞的位置以及原位 CXCL12 的表達(dá)，作者利用多重免疫標(biāo)記（IF），在遠(yuǎn)離 TLS 的地方發(fā)現(xiàn)PC 沿著成纖維細(xì)胞軌道排列，嵌入在密集的 COL1+ CXCL12+ 成纖維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中，從而證明它們?cè)谀[瘤床中的遷移。數(shù)據(jù)分析了 Ig 和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物的共表達(dá)，以及成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物和 CXCL12 的共表達(dá)，并驗(yàn)證了PC 在 TLS 內(nèi)的位置以及空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)確定的成纖維細(xì)胞網(wǎng)狀細(xì)胞 (FRC) 在空間上的位置。值得注意的是，在被 MUM1+ IgG+成纖維細(xì)胞軌道包圍的腫瘤巢中檢測(cè)到與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的 IgG。

5. TLS and Ig-producing PCs 與結(jié)合到凋亡腫瘤細(xì)胞的 IgG 抗體和對(duì)免疫治療的反應(yīng)相關(guān)

為了進(jìn)一步研究 TLS、腫瘤內(nèi)PC和Ig染色之間的聯(lián)系，首先分析了TLS成熟度。作者研究了 103 個(gè)腫瘤中 TLS 的存在與 PC 密度之間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)含有 CD23+ FDC 網(wǎng)絡(luò)、BCL6+ 細(xì)胞和 PNAd+ HEV 的 TLS 與 ?MUM1+IgG+ PC 和 MUM1+IgA+ PC 密度之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。后面又進(jìn)一步研究了 57 個(gè) TLS+ 樣本上 TLS 成熟度標(biāo)記與 MUM1+IgG+ 和 ?MUM1+IgA+ PCs 密度的相關(guān)性。

作者為了揭示腫瘤結(jié)合IgG抗體的功能，分析腫瘤細(xì)胞凋亡特征，結(jié)果顯示在IgG+腫瘤細(xì)胞＞60%的樣本中， Caspase 3活化的腫瘤細(xì)胞密度顯著升高。CD68+巨噬細(xì)胞與IgG+/cleaved caspase 3+腫瘤細(xì)胞距離更近。

總結(jié)

腫瘤的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）會(huì)影響癌癥免疫治療的效果。文章采用10x Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法對(duì)冰凍切片和FFPE切片進(jìn)行測(cè)序，鑒定腎細(xì)胞癌三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)特征，以及漿細(xì)胞傳播途徑與腫瘤細(xì)胞Caspase3活化和免疫抑制劑治療應(yīng)答的關(guān)系，揭示了前人未發(fā)現(xiàn)的在癌組織中B細(xì)胞對(duì)治療和預(yù)后的顯著意義，為未來腎細(xì)胞癌治療提供了思路。

參考文獻(xiàn)：

Meylan M, Petitprez F, Becht E, et al. Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer[J]. Immunity.?2022 Mar 8;55(3):527-541.