肺癌是常見的癌癥類型之一，絕大部分病例確認診斷時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，無法進行手術切除，導致五年生存期不足20%，而IV期病人五年存活率僅有6%。因其高發(fā)病率和高致死率，肺癌已經(jīng)成為了人類生命健康的重要威脅。靶向治療和免疫治療的快速發(fā)展帶來了新的方法，但目前仍受制于有限的生物標志物和治療組合方式。基于高通量測序技術的發(fā)展，人們對肺癌有了更多的認識，揭示了很多與肺癌密切相關的基因突變。然而，越來越多的證據(jù)顯示，腫瘤的發(fā)生發(fā)展并不是簡單的基因突變的集合。腫瘤組織出現(xiàn)異常的直接原因是執(zhí)行功能的蛋白質(zhì)發(fā)生了異常變化，而這些異常并不能在基因?qū)用姹煌耆从吵鰜?。藥物作用的直接靶點都是蛋白質(zhì)，而非基因。檢測基因也是旨在能夠間接反映出其對應蛋白質(zhì)層面的功能信息。隨著現(xiàn)代質(zhì)譜的發(fā)展，科學家們可以直接測定藥物真正靶向的分子，即蛋白組。蛋白組分析的一個重要特點是不但能分析樣本組織中的癌細胞，還包括其中的間質(zhì)和浸潤免疫細胞。從而可以提供更加完整的分子表型全景圖，幫助人們從整體的角度理解腫瘤的特征。因此，直接檢測臨床腫瘤樣品的蛋白質(zhì)組，是未來研究的必然趨勢。那么，接下來通過幾篇文獻一起看看蛋白質(zhì)組學在肺癌方面的應用。

前沿文獻PART?01

蛋白生物標志物有助于疾病的早期診斷、療效評估、為治療和預后判斷提供指導。運用蛋白質(zhì)組學在臨床病人體液或組織中，尋找和發(fā)現(xiàn)有價值的生物標志物已經(jīng)成為目前研究的一個重要熱點。尿液樣本的易于獲得的、無創(chuàng)收集和廣泛的診斷目標使得尿液分析非常適合臨床（PoC）監(jiān)測應用。在疾病早期階段，機體尚能代償?shù)臅r候，血液受機體穩(wěn)態(tài)機制的控制，疾病早期難以產(chǎn)生穩(wěn)定的變化，而在這個過程中，尿液以各種形式收集血液在穩(wěn)態(tài)機制控制下排除出的廢物，其中包括很多疾病相關的變化。因此相較于目前臨床檢測常用的血液樣本，尿液樣本具有完全無創(chuàng)，可連續(xù)收集、更容易檢測低豐度蛋白、早期發(fā)現(xiàn)、檢測敏感、特異性強等諸多優(yōu)勢。

標題：Urine Proteome Profiling Predicts Lung Cancer from Control Cases and Other Tumors

期刊：EBioMedicine（IF =11.205）

文章摘要：

技術策略：

收集的健康個體（n = 33）、良性肺部疾?。╪ = 40）、肺癌（n = 33）、膀胱癌（n = 17）、宮頸癌（n = 25）、結(jié)直腸癌（n = 22）、食道癌（n = 14）和胃癌（n = 47）患者的231份人類尿液樣本進行了非標蛋白質(zhì)組學分析，通過隨機森林建模，篩選出一份可以將肺癌與其他病例分開的尿液蛋白質(zhì)列表。通過特征選擇算法，選擇了一組五種尿液生物標志物，并建立了一個組合模型，可以在訓練組（n = 46）和測試組（n = 14-47每組）中正確分類大多數(shù)肺癌病例。

結(jié)果速遞：

蛋白組學鑒定并定量了尿液樣本中7408種蛋白質(zhì)，通過差異篩選與豐度篩選，選擇了68種相對豐度可在超過70%的肺癌尿液標本中檢測到的蛋白作為候選蛋白質(zhì)。而后構建隨機森林模型（預測模型通過特征算法選擇了?5?種蛋白質(zhì)FTL、MAPK1IP1L、FGB、RAB33B?和?RAB15），為了評估預測的準確性，在由10名健康對照和10名年齡和性別匹配的肺癌患者組成的獨立驗證集上進行測試，預測模型能夠正確分類9個尿液樣本和9個健康對照。五種臨床使用的腫瘤標志物（AFP，CA 19-9，CA 125，CA 15-3和CEA），33名肺癌患者中有8名患者血液中的標志物表達水平顯示正常，表明使用這些標志物的假陰性率很高，而模型中的蛋白質(zhì)FTL具有佳的判別力，AUC為0.9073。

由于只有極少數(shù)研究評估了生物標志物在將肺癌與其他疾病進行分類方面的特異性。為了評估癌癥特異性，作者在其余數(shù)據(jù)集預測模型對肺癌病例的分類情況。分別對BC、CCA、CRC、EC和GC的LC進行分類，誤差為18%、13.8%、20%、6.4%和12.5%。說明該模型能夠在所有測試集中以高靈敏度（>93%）將肺癌與其他癌癥區(qū)分開來。單個標志物FTL可以在5個測試組中將LC與其他癌癥區(qū)分開來，AUC>0.81。與其他四個標志物相比，F(xiàn)TL是重要的標志物。五種尿液生物標志物的組合不僅可以區(qū)分肺癌患者和對照組，還可以將肺癌與其他常見腫瘤區(qū)分開來。生物標志物指標和預測模型在多環(huán)境通過更多樣本驗證時，可與肺癌檢測的成像技術一起用作輔助診斷工具。

前沿文獻?PART?02

基于質(zhì)譜（MS）的蛋白質(zhì)組學可以對復雜的生物系統(tǒng)（如細胞、組織或血漿）進行大規(guī)模分析。使用現(xiàn)代高分辨率質(zhì)譜儀和的樣品制備工作流程，可以并行檢測與定量數(shù)千種蛋白質(zhì)，包括豐度較低的蛋白質(zhì)，從而更好地了解癌癥中的分子相互作用和信號通路。小細胞肺癌（SCLC）分子亞型主要基于以下關鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的表達模式進行表征：ASCL1（SCLC-A），NEUROD1（SCLC-N），POU2F3（SCLC-P）和YAP1（SCLC-Y）。作者針對性研究了這些分子亞群的蛋白質(zhì)組學景觀，旨在鑒定具有診斷和治療相關性的新亞型特異性蛋白質(zhì)。

標題：In-depth proteomic analysis reveals unique subtype-specific signatures in human small-cell lung cancer

期刊：Clinical and Translational Medicine（IF =8.554）

文章摘要：

技術策略：

使用人SCLC細胞系（26種細胞系），采用數(shù)據(jù)獨立采集（DIA）質(zhì)譜法對樣品進行定量測量，評估細胞沉淀（CP）和培養(yǎng)基（CM）定量了近9000種蛋白質(zhì)。與現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)集相結(jié)合，旨在更清楚地定義SCLC亞型，提供對其控制治療反應的特征見解。

結(jié)果速遞：

1、SCLC細胞系通過基于MS的蛋白質(zhì)組學分為四種不同的亞型通過蛋白質(zhì)組學檢測?SCLC?細胞系的分子異質(zhì)性，表征了來自人原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性SCLC病變的26種細胞系， 使用DIA蛋白質(zhì)組學技術分析，共鑒定定量了?10161?種蛋白質(zhì)。根據(jù)關鍵基因ASCL1，NEUROD1，POU2F3和YAP1的表達，將細胞系分為四個相應的亞組，這些轉(zhuǎn)錄因子在其各自的亞型中也顯示出蛋白質(zhì)水平的增加。通過比較具有不同特性（如培養(yǎng)類型，細胞系起源和化療）的細胞系之間的神經(jīng)內(nèi)分泌（NE）特征和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）特征評分，發(fā)現(xiàn)貼壁細胞系的NE評分明顯低于非貼壁細胞系。此外，NE和EMT評分之間存在顯著的負相關。培養(yǎng)過程中細胞系也顯示出顯著不同的生長特征，在26個細胞系中，10個（38.5%）懸浮生長，3個（11.5%）半貼壁形式生長，另外13個（50.0%）貼壁形式生長。貼壁和非貼壁細胞系顯示出明顯不同的蛋白質(zhì)表達譜，結(jié)合差異蛋白與KEGG富集分析情況均證明了蛋白質(zhì)水平上的表型細胞系差異。對CP樣品進行無監(jiān)督的共識聚類。分析揭示了蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中的四個聚類，與基于mRNA的分型相一致。

2、蛋白質(zhì)組學分析確定?SCLC?亞型的潛在診斷標志物和成藥靶標除差異表達分析外，分別對?CP?和?CM?進行?sPLS-DA，根據(jù)其表達模式鑒定適合亞型分類的蛋白質(zhì)。分析結(jié)果是104種蛋白質(zhì)在至少兩種亞型之間顯示出明顯不同的特征。數(shù)據(jù)概述了六種在亞型中顯示出顯著豐度差異的蛋白質(zhì)，同時也是FDA批準的藥物靶標，即DDC（在SCLC-A中過表達），EPHA2，ITAV和ITB1（對應于基因EPHA2，ITGAV和ITGB1，在SCLC-Y中過表達），HDAC1（在SCLC-Y中下調(diào)）和KIT（在SCLC-P中上調(diào)）。這些標志物可能有助于未來的亞型診斷。

前沿文獻PART?03

通常情況下，蛋白質(zhì)組學分析的做法是處理新鮮冷凍的腫瘤組織。然而，由于新鮮冷凍標本的腫瘤收集在總樣本數(shù)量方面會受到限制，并且這些樣品往往缺乏足夠長的隨訪信息，導致了其實際的研究意義受限。因此，福爾馬林固定石蠟包埋?(FFPE)?標本因其長期的穩(wěn)定性與含有臨床結(jié)果的常見信息等優(yōu)勢，成為回顧性研究中十分有吸引力的資源。

標題：Comprehensive micro-scaled proteome and phosphoproteome characterization of archived retrospective cancer repositories

期刊：NatureCommunications（IF =17.694）

文章摘要：

技術策略：

評估了蛋白質(zhì)組學在FFPE肺組織上關于蛋白質(zhì)提取，定量，預分析和樣本量的可行性。1、比較蛋白質(zhì)提取方案，使用性能較佳的方案從肺鱗狀細胞和腺癌中深度檢測（磷酸化）蛋白質(zhì)組，具有>8000個定量蛋白質(zhì)和>14000個磷酸化位點2、通過微量蛋白組學方法，能夠分析組織量有限的FFPE活檢。3、研究了分析前變量（包括固定時間和熱輔助去交聯(lián)）對蛋白質(zhì)提取效率和蛋白質(zhì)組覆蓋率的影響。改進的工作流程為肺癌中相關的癌基因、腫瘤抑制因子和信號通路提供了有關蛋白質(zhì)豐度和磷酸化調(diào)控的定量信息。

結(jié)果速遞：

首先比較了三種已發(fā)表的從?FFPE?樣品中提取蛋白質(zhì)的方案，由整體蛋白質(zhì)組覆蓋率、肺癌相關的蛋白質(zhì)組覆蓋率以及四次重復的高可重復性等方面的結(jié)果表明 ，SDS-SP3在三種測試方案中從肺癌?FFPE?樣本中提取蛋白質(zhì)的效果佳。

其次，對新鮮冷凍與福爾馬林固定標本的蛋白質(zhì)組進行直接比較，結(jié)果顯示蛋白質(zhì)鑒定沒有重大差異，其對蛋白質(zhì)鑒定質(zhì)量的影響很小。使用新鮮制備的福爾馬林固定細胞進行的細胞系實驗也顯示，與新鮮冷凍材料相比，蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組覆蓋率只有很小的差異。表明對于大型臨床?FFPE?隊列的蛋白質(zhì)組學分析的研究設計，固定時間不一定是選擇標準。同時?TMT?技術可以成功應用于臨床?FFPE?樣本，提供有關蛋白質(zhì)表達和磷酸化水平的相關信息。并且TMT方法非常適合對切除的?FFPE?組織進行研究，通過優(yōu)化?TMT?技術使得即使是少量樣本也能實現(xiàn)深度蛋白質(zhì)組覆蓋。對于切片的?FFPE?組織，通過?TMT?實驗可以定量檢測到?8000多種蛋白質(zhì)和超過14000?個磷酸化位點。

之后對常用?FFPE?蛋白質(zhì)提取方案、蛋白質(zhì)組學量化方法和不同?FFPE?樣本類型的樣本量要求進行系統(tǒng)比較，指出LFQ?只需要少量的樣本進行蛋白質(zhì)組分析，樣本制備時間相對較短，在質(zhì)譜儀上每個樣品的測量時間少。因此，LFQ?特別適合研究中等覆蓋率的數(shù)百個樣本的大型隊列。然而，對于磷酸化蛋白質(zhì)組分析，由于對每個樣本的樣本量要求相對較高，該方法受到限制。TMT?方法可提供更深的蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組，但考慮到用于標記、分級和脫鹽的額外樣品處理步驟，需要相對較高的樣本量和更多的樣本制備時間。而微尺度?TMT?方法的一個明顯優(yōu)勢就是它提供了對蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組水平的深入覆蓋的同時，又不需要較高的樣本量，從而能夠?qū)Ψ浅Ｐ〉呐R床標本（例如針芯活檢）進行全面的蛋白質(zhì)組學表征。

整體而言，質(zhì)譜驅(qū)動的蛋白質(zhì)組學LFQ?和?TMT?中常用的量化方法在分析?FFPE?組織方面都有不同的應用，各自具有不同的優(yōu)勢和劣勢，并在功能蛋白質(zhì)組水平上提供了多種技術選項來探索癌癥基因的改變。