寫在前面

????????今天推薦的是由普林斯頓大學(xué)分子生物學(xué)系在2020年8月7日發(fā)表于GENES & DEVELOPMENT（2020IF：11.360，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Yibin Kang教授，研究表明去泛素化酶USP20通過穩(wěn)定SNAI2促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移。

研究背景

????????SNAI2（也稱為SLUG）是SNAIL家族轉(zhuǎn)錄因子的三個成員之一，通過增強(qiáng)細(xì)胞遷移和侵襲來促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移，促進(jìn)轉(zhuǎn)移細(xì)胞的存活，并增強(qiáng)乳腺癌干細(xì)胞的活性。在許多癌癥類型中觀察到SNAI2表達(dá)升高，并且與轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險增加以及各種癌癥患者的生存期縮短相關(guān)。

摘要部分

????????SNAI2/SLUG是一種促進(jìn)轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)錄因子，是一種不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，可通過泛素蛋白酶體降解系統(tǒng)進(jìn)行降解。在這里，作者使用包含65個基因的人類DUBcDNA文庫和包含98個基因的siRNA文庫進(jìn)行了全面的功能增益和功能喪失篩選，并將USP20鑒定為一種可調(diào)節(jié)SNAI2泛素化和穩(wěn)定性的去泛素化酶(DUB)。USP20的進(jìn)一步研究證明了其在促進(jìn)乳腺癌遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移方面的作用。USP20與乳腺腫瘤樣本中的SNAI2蛋白水平呈正相關(guān)，較高的USP20表達(dá)與ER-乳腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。

研究內(nèi)容

1.SNAI2調(diào)節(jié)DUB的鑒定? ? ?

????????為了鑒定可能去泛素化和穩(wěn)定SNAI2的DUB，作者在人類DUB siRNA文庫進(jìn)行篩選。作者在三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中進(jìn)行了siRNA篩選，該細(xì)胞系具有相對較高的內(nèi)源性SNAI2表達(dá)。選擇最顯著降低SNAI2水平的前20個DUB基因敲低進(jìn)行第二輪篩選。在這20個候選中，兩個基因USP20和USP52的敲低導(dǎo)致SNAI2蛋白水平與對照相比降低到不到一半。

????????為了補(bǔ)充siRNA文庫篩選，作者還通過免疫共沉淀篩選了DUBcDNA文庫，以檢查每個DUB與SNAI2的相互作用。這些DUB中的每一個都與SNAI2在293T細(xì)胞中共同過表達(dá)。使用HA抗體拉下DUB進(jìn)行共免疫沉淀（co-IP）實驗，并在co-IP樣品中探測SNAI2。65個DUB被HA抗體成功拉下，其中包括USP20在內(nèi)的20個DUB顯示出與SNAI2的相互作用。本研究的重點是USP20，這是基于這兩種篩選重疊的最有希望的候選藥物。

研究結(jié)論：作者使用包含65個基因的人類DUB cDNA文庫和包含98個基因的siRNA文庫進(jìn)行了全面的功能增益和功能喪失篩選，并將USP20鑒定為可以與SNAI2作用的最有希望的候選藥物。

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2.USP20通過去泛素化SNAI2抑制SNAI2降解

????????作者進(jìn)一步研究了USP20在調(diào)節(jié)SNAI2穩(wěn)定性方面的作用。首先，作者證實SNAI2蛋白水平的降低不是由于SNAI2 mRNAs的下調(diào)。接下來，作者測試了USP20是否可以去泛素化SNAI2。收集蛋白質(zhì)樣品前用MG132處理細(xì)胞6小時，以抑制蛋白酶體降解，從而積累多泛素化SNAI2并在以后檢測。拉下內(nèi)源性SNAI2蛋白，使用抗泛素抗體檢測多泛素化SNAI2。當(dāng)USP20被敲低時，觀察到SNAI2的多聚泛素化水平更高。在穩(wěn)定過表達(dá)SNAI2的MDA-MB-231細(xì)胞中也進(jìn)行了類似的泛素化測定。只有野生型USP20而非催化失活突變體USP20-C154S的過表達(dá)降低了SNAI2多泛素化?？傊?，這些泛素化分析表明USP20是SNAI2真正的去泛素化酶。由于多泛素化SNAI2被蛋白酶體靶向降解，作者通過放線菌酮(CHX)追蹤試驗測試了USP20敲低對SNAI2降解率的影響。細(xì)胞有無CHX(50μg/mL)處理以抑制新的蛋白質(zhì)合成，隨后通過蛋白質(zhì)印跡確定CHX處理后剩余的SNAI2水平。與泛素化分析結(jié)果一致，野生型而非催化失活突變體USP20的過表達(dá)穩(wěn)定了SNAI2，而USP20敲低導(dǎo)致SNAI2降解加速。

研究結(jié)論：USP20通過去泛素化SNAI2來穩(wěn)定SNAI2。

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3.USP20敲低通過減少SNAI2抑制遷移和侵襲

????????作者敲低了LM2，SCP28和SUM159-M1a細(xì)胞中的USP20。正如預(yù)期的那樣，在敲除USP20后SNAI2蛋白水平降低，且這種效應(yīng)是SNAI2特有的。另一方面，野生型USP20而非催化失活突變體USP20-C154S的表達(dá)增加了過表達(dá)SNAI2的LM2細(xì)胞中的SNAI2水平。眾所周知，SNAI2可促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。為了測試USP20是否可以通過靶向SNAI2來調(diào)節(jié)遷移和侵襲，作者進(jìn)行了Transwell遷移和侵襲試驗。當(dāng)使用siRNA在SCP28細(xì)胞中敲除USP20或SNAI2時，與用對照siRNA處理的細(xì)胞相比，遷移的細(xì)胞數(shù)量顯著減少。使用高度轉(zhuǎn)移性LM2細(xì)胞的侵襲測定觀察到類似的結(jié)果。與SNAI2敲低細(xì)胞類似，與對照細(xì)胞相比，USP20敲低的細(xì)胞顯示出顯著較低的侵襲能力。重要的是，SNAI2過表達(dá)完全恢復(fù)了USP20或SNAI2敲低對侵襲的影響，表明USP20對遷移和侵襲的影響是由SNAI2介導(dǎo)的。對照、USP20和SNAI2敲低LM2細(xì)胞的微陣列分析顯示，許多遷移/侵襲相關(guān)基因在USP20和SNAI2敲低細(xì)胞中顯示出一致的變化，表明USP20和SNAI2在調(diào)節(jié)遷移和侵襲方面具有相似的下游效應(yīng)子。

研究結(jié)論：USP20敲低通過減少SNAI2來抑制細(xì)胞侵襲。

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4.USP20敲低抑制乳腺癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移

????????鑒于SNAI2在轉(zhuǎn)移中的重要作用，作者接下來研究了USP20對乳腺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的影響。首先，作者使用含有USP20靶向shRNA的慢病毒生成了具有穩(wěn)定USP20敲低的細(xì)胞系。首次生成細(xì)胞系時，SNAI2的蛋白質(zhì)水平降低。然而，USP20敲低細(xì)胞中的SNAI2蛋白水平在多次傳代后恢復(fù)，這可能是細(xì)胞發(fā)展了補(bǔ)償機(jī)制以重新獲得SNAI2表達(dá)。因此，作者使用兩種不同的siRNA敲低USP20，證實siRNA敲低效果至少持續(xù)10天，這足以進(jìn)行體內(nèi)實驗肺定植研究。螢火蟲熒光素酶標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染的SUM159-M1a和LM2細(xì)胞被靜脈注射到NSG小鼠中，并使用生物發(fā)光成像(BLI)監(jiān)測它們在肺中的轉(zhuǎn)移性播種和生長。注射后五天，與對照細(xì)胞相比，USP20或SNAI2敲低細(xì)胞在肺中接種的癌細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)顯著減少。在4周后處死小鼠并計數(shù)肺上的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。在USP20和SNAI2敲低組中觀察到的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)明顯減少，這可能是由于肺播種減少以及增殖適度減少所致。

研究結(jié)論：USP20敲低抑制了乳腺癌細(xì)胞的肺定植，從而減少了轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的形成。

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5.USP20與臨床乳腺癌樣本中的SNAI2呈正相關(guān)

????????因為在ER乳腺癌患者中，較高的SNAI2 mRNA水平與較差的預(yù)后相關(guān)，作者將臨床研究重點放在ER乳腺癌患者上。作者首先使用在線Kaplan-Meier繪圖儀工具在大型公共臨床微陣列數(shù)據(jù)庫中測試了 USP20 的預(yù)后價值。USP20 mRNA的較高表達(dá)與較差的無轉(zhuǎn)移存活相關(guān)，這與作者在小鼠中觀察到的USP20促進(jìn)轉(zhuǎn)移一致。作者使用TCGA-BRCA樣本集在ER-乳腺癌患者的mRNA水平上測試了USP20和SNAI2之間的相關(guān)性。在USP20和SNAI2 mRNA表達(dá)之間沒有觀察到顯著相關(guān)性。為了確定USP20在蛋白質(zhì)水平上是否與SNAI2相關(guān)，作者接下來收集了84名ER-乳腺癌患者的乳腺癌樣本，并使用IHC染色檢查了SNAI2和USP20蛋白質(zhì)水平。發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白質(zhì)表達(dá)模式顯示出顯著的正相關(guān)。重要的是，正如它們的促轉(zhuǎn)移功能所預(yù)期的那樣，乳腺癌組織中較高的USP20和SNAI2蛋白質(zhì)水平與乳腺癌患者的無復(fù)發(fā)生存率和無轉(zhuǎn)移生存率較差相關(guān)。作者對乳腺癌患者樣本中的USP20和SNAI2的研究證明了USP20具有良好的臨床相關(guān)性。因此，作者的發(fā)現(xiàn)提供了一種新的潛在治療選擇，通過間接抑制蛋白酶USP20來降低乳腺癌患者的SNAI2水平。

研究結(jié)論: USP20與臨床乳腺癌樣本中的SNAI2呈正相關(guān)。

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結(jié)論與討論

????????盡管轉(zhuǎn)錄因子SNAI2在調(diào)節(jié)乳腺癌轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但目前還沒有直接靶向SNAl2的藥物。由于DUBs比SNAl2本身更容易制成藥物，識別和穩(wěn)定SNAI2的DUBs可以作為降低SNAI2水平和抑制腫瘤進(jìn)展的新藥物靶點。在這里，作者對siRNA和cDNA文庫進(jìn)行了全面篩選，并確定USP20是真正的SNAI2穩(wěn)定DUB，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。

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Thank you!

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原文鏈接：https://genesdev.cshlp.org/content/34/19-20/1310