前言

鎘是一種廣泛存在于環(huán)境中的有毒重金屬,廣泛存在于環(huán)境中。慢性和低劑量 Cd 暴露與循環(huán)毒性、腎損傷、中樞和外周神經(jīng)毒性、肺部疾病、角化過度和皮膚棘皮癥有關(guān)。此外，鎘化合物作為已鑒定的致癌物也參與了人類肺癌、前列腺癌和腎癌的發(fā)病機制。流行病學研究表明，尿鎘含量與空腹血糖受損顯著相關(guān)。然而，鎘暴露胰腺β細胞代謝毒性特征與潛在的分子事件及機制尚不清楚。

2022年03月，浙江大學公共衛(wèi)生學院周舟團隊在環(huán)境科學頂刊《Environment International》雜志發(fā)表題為 “Cadmium perturbed metabolomic signature in pancreatic beta cells correlates with disturbed metabolite profile in human urine”( IF13.352)的研究成果，通過采用轉(zhuǎn)錄組，非靶向代謝組學等技術(shù)，首次揭示了鎘誘導(dǎo)的代謝紊亂在胰島β細胞功能障礙中的重要作用，強調(diào)了從人群水平控制鎘暴露降低糖尿病發(fā)病風險的重要性。

研究思路

胰腺β細胞功能障礙是糖尿病發(fā)病機制中的關(guān)鍵事件。葡萄糖及其代謝物、脂質(zhì)分子及其代謝物協(xié)同調(diào)節(jié)胰腺 β 細胞功能。脂毒性代謝物通過誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對胰腺 β 細胞中的胰島素產(chǎn)生和分泌產(chǎn)生不利影響(ER) 壓力和線粒體損傷。因此，闡明代謝紊亂和脂毒性代謝物在 Cd 誘導(dǎo)的胰腺 β 細胞功能障礙中的作用非常重要。Cd 暴露是否以及如何擾亂線粒體 TCA 循環(huán)并產(chǎn)生脂毒性代謝物對于了解 Cd 暴露的代謝毒性至關(guān)重要。

本研究的目的是揭示胰腺 β 細胞中 Cd 暴露的代謝組學特征，從而為了解 Cd 誘導(dǎo)的與胰腺 β 細胞損傷和糖尿病發(fā)病機制相關(guān)的代謝毒性提供全代謝組水平的新證據(jù)。

研究思路

研究結(jié)果

1、鎘暴露在體內(nèi)和體外造成胰腺β細胞功能障礙

為了測試鎘暴露對胰腺β細胞功能的毒性作用，作者首先檢測了鎘暴露后小鼠的血糖水平（圖1A）。此外，作者進行了腹腔內(nèi)葡萄糖耐量試驗以測量胰腺β細胞功能（圖 1B-C）。通過HE染色觀察Cd暴露小鼠胰島的形態(tài)學損傷（如圖1D所示）。通過免疫熒光染色用于特異性標記胰腺β細胞和α細胞。發(fā)現(xiàn)在鎘暴露后分泌胰島素的β細胞顯著減少，而胰高血糖素分泌細胞沒有改變（圖1E）。

為了進一步驗證 Cd 暴露是否在體外誘導(dǎo)胰腺 β 細胞功能障礙，作者在體外測量了 CdCl 2對 MIN6 細胞的毒性作用 (圖 1F-G）。同時檢查鎘暴露對 MIN6 細胞胰島素分泌的劑量和時間影響（圖1 H 所示）。在 Cd 暴露后 24 小時，MIN6 細胞分泌的胰島素含量顯著降低。在一項時程研究中，觀察到胰島素分泌的減少早在Cd暴露后 3 小時就發(fā)生了(圖 1 I)。綜上所述，這些在體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)表明，鎘暴露會導(dǎo)致葡萄糖耐受不良、胰島受損、抑制胰腺 β 細胞胰島素分泌。

圖1 | Cd 暴露抑制 C57BL/6 小鼠和 MIN6 細胞中的胰島素分泌

2、Cd 暴露改變了 MIN6 細胞的代謝組學特征

為了探索 MIN6 細胞中 Cd 暴露在代謝組水平上的代謝毒性，作者對暴露后 24 小時的 MIN6 細胞進行了基于 LC-MS/MS 的代謝組學分析。主成分分析 (PCA) 顯示對照組和 Cd 處理組之間存在顯著差異（圖 2A)，表明 Cd 暴露導(dǎo)致細胞代謝組學譜發(fā)生顯著變化。Cd 暴露導(dǎo)致由正 ESI 模式確定的 MIN6 細胞中的顯著代謝破壞（圖 2乙）。OPLS-DA 計算模型的質(zhì)量良好（圖 2 C）?；鹕綀D顯示了調(diào)整后的p值與代謝物強度相對于 Cd 暴露的倍數(shù)變化 (FC) 幅度之間的關(guān)系 (圖 2 D)。這些結(jié)果清楚地表明，鎘暴露顯著改變了 MIN6 細胞中的代謝組學特征。

圖2 | Cd 暴露改變了 MIN6 細胞中的代謝物譜

3、Cd擾動代謝物的亞細胞定位

細胞器之間代謝物的動態(tài)相互作用是協(xié)調(diào)細胞內(nèi)代謝平衡的重要機制。為了揭示 Cd 暴露顯著改變的代謝物的細胞內(nèi)區(qū)室，作者進一步分析了 MIN6 細胞中受擾動的代謝物的亞細胞分布。發(fā)現(xiàn)擾動的代謝物廣泛分布在細胞質(zhì)和細胞器中（圖 3A)。作者進一步分析了這些位于線粒體的代謝物的化學超類組成。發(fā)現(xiàn)核苷、核苷酸和類似物占線粒體代謝物的大部分（圖 3 B）。在分層聚類分析的熱圖中觀察到 28 種線粒體代謝物的兩個不同的差異，如圖 3所示C，表明線粒體代謝受到鎘暴露的顯著干擾。在這 28 種代謝物中，26 種代謝物顯著增加，而2種代謝物（DL-2-氨基己二酸、甜菜堿）顯著增加減少。

細胞內(nèi)細胞器之間代謝通量的動態(tài)串擾調(diào)節(jié)細胞功能。細胞器中受干擾的代謝物會破壞代謝通量和細胞器相互作用。因此，作者通過維恩圖分析進一步剖析了位于線粒體、溶酶體和ER中的改變代謝物的組成（圖 3 D）.鑒于線粒體是細胞氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，而過氧化物酶體被認為是脂質(zhì)和氧化還原信號網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵樞紐，因此使用維恩圖分析了線粒體和過氧化物酶體中受到干擾的代謝物。作者發(fā)現(xiàn)線粒體和過氧化物酶體中均存在 9 種改變的代謝物 (圖 3 E)，這表明線粒體功能和氧化應(yīng)激可能會受到 Cd 暴露的代謝毒性的干擾.

圖3 | Cd 暴露在 MIN6 細胞中擾動代謝物的細胞定位

4、Cd 暴露擾亂了代謝途徑和升高的脂毒性代謝物

為了揭示 MIN6 細胞中 Cd 暴露干擾的顯著差異的代謝途徑，作者通過KEGG分析表示差異顯著性的p值和反映受影響途徑影響嚴重程度的差異表達代謝物的數(shù)量（如圖 4 所示），結(jié)果表明 Cd 暴露會導(dǎo)致 MIN6 細胞出現(xiàn)整體代謝紊亂。線粒體TCA循環(huán)、甘油磷脂代謝、膽堿代謝、嘧啶代謝、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝等代謝途徑均受到明顯干擾。

為了進一步描述脂毒性代謝物與線粒體代謝物之間的關(guān)系，作者進行了 Pearson 相關(guān)分析。相關(guān)網(wǎng)絡(luò)表明脂毒性代謝物與線粒體代謝物密切相關(guān)（圖4C）。這些結(jié)果支持線粒體作為鎘暴露代謝毒性的主要靶細胞器。

圖4 | Cd 暴露會擾亂代謝途徑并提高 MIN6 細胞中的脂毒性代謝物

5、Cd 暴露在線粒體 TCA 循環(huán)和相關(guān)脂肪酸氧化中的基因表達失調(diào)

為了驗證 Cd 暴露對線粒體 TCA 循環(huán)和相關(guān)脂肪酸氧化的毒性作用，作者運用轉(zhuǎn)錄組測序檢測了 Cd 暴露后 MIN6 細胞和小鼠胰腺中調(diào)節(jié)線粒體 TCA 循環(huán)和相關(guān)脂肪酸氧化的基因的 mRNA 表達。如圖5A，在MIN6細胞（圖5A）和小鼠胰腺（圖5A）中， Idh3b、Ogdh和Etfdh mRNA表達顯著下調(diào)，Mdh2、Etfa mRNA表達顯著上調(diào)。Cd 暴露后。這些數(shù)據(jù)表明 Cd 暴露會失調(diào)線粒體 TCA 循環(huán)中的基因表達。

在驗證 Cd 暴露對脂肪酸氧化的影響時，作者檢測了脂肪酸氧化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Fa2h、Pycr1和Hsd17b10基因的 mRNA 表達。發(fā)現(xiàn)Fa2h和Pycr1在MIN6細胞和小鼠胰腺中mRNA表達顯著下調(diào)（圖5B-D）。總之，這些結(jié)果進一步表明，鎘暴露通過失調(diào)基因表達損害線粒體 TCA 循環(huán)和相關(guān)的脂肪酸氧化。

圖5 | Cd 暴露使 MIN6 細胞和小鼠胰腺中與線粒體 TCA 循環(huán)和脂肪酸代謝相關(guān)基因的 mRNA 表達失調(diào)

6、尿中 Cd 擾動代謝物的鑒定

為了探索在 MIN6 細胞中鑒定出的擾動代謝物是否與人類接觸 Cd 的代謝毒性相關(guān)，作者首先在人樣本進行了非靶向代謝組學分析以鑒定 Cd 擾動的尿代謝物，然后評估與糖尿病發(fā)病機制的相關(guān)性。對比分析了15名高濃度鎘暴露工人和15名健康人的尿液樣本（樣本策略）。主成分分析（PCA）的得分圖顯示健康受試者和 Cd 暴露工人之間存在顯著差異（圖 6A)，表明 Cd 暴露導(dǎo)致尿液中代謝物譜發(fā)生顯著變化。Cd 暴露導(dǎo)致尿液中的代謝物顯著擾動（圖 6 B）。

在 Cd 暴露工人的尿液中共鑒定出 53 種受干擾的代謝物。作者選擇前20個受擾動的代謝物進行ROC曲線，用于評估作為Cd毒性生物標志物的特異性和敏感性。代謝途徑富集顯示 34 種代謝途徑受到人類 Cd 暴露的顯著干擾（圖6D）。

為了測試受擾動的代謝物是否可以反映線粒體代謝的紊亂，作者發(fā)現(xiàn)線粒體代謝特征被顯著破壞。線粒體中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、檸檬酸循環(huán)、胰高血糖素信號通路、ABC 轉(zhuǎn)運蛋白和硫胺素代謝的層次聚類受到干擾（圖 6 F）。這些結(jié)果表明，Cd 對線粒體代謝的毒性可以通過尿液中的代謝物紊亂來指示。

圖6 | 血清LC-MS代謝組學分析及其與蛋白質(zhì)組學的相關(guān)性

7、血脂代謝組學分析結(jié)果及其與蛋白質(zhì)組學的相關(guān)性

首先，作者檢查了 Cd 擾亂胰腺 β 細胞中的代謝物是否共存于 Cd 暴露工人的尿液中。結(jié)果顯示，14 種受干擾的代謝物共存于 Cd 暴露的 MIN6 細胞和 Cd 暴露工人的尿液中（圖 7A）。在細胞和人體尿液樣本中這 14 種重疊代謝物中，12 種在 Cd 暴露工人的尿液中顯著增加，2 種顯著減少。

尿液中受干擾的代謝物已被認為是預(yù)測和診斷糖尿病的代謝組學生物標志物。接下來，作者從暴露于 Cd 的工人中受擾動的代謝物中篩選出作為糖尿病代謝組學生物標志物的尿液代謝物。與對照組相比，Cd 暴露工人尿液中 11 種糖尿病代謝組學生物標志物的豐度顯著改變（圖 7 B）。Veen 圖顯示，人尿中 11 個代謝組學生物標志物有 3 個重疊代謝物，細胞和人尿樣品中有 14 個共存代謝物（圖 7C）。最后，作者檢查了 3 種重疊代謝物作為 Cd 暴露代謝毒性生物標志物的特異性和敏感性。進行 ROC 曲線。L-谷氨酰胺 (0.751)、硫胺素 (0.960) 和?；撬?(0.849) 在 95% 置信區(qū)間內(nèi)的 AUC 值表明這 3 種代謝物具有良好的預(yù)測性能（圖 7 D-F）。

總之，這些結(jié)果表明，在全代謝組水平的 MIN6 細胞中鑒定出的擾動代謝物與人類接觸鎘的代謝毒性密切相關(guān)。尿液中的 L-谷氨酰胺、硫胺素和牛磺酸可用于預(yù)測和監(jiān)測 Cd 誘導(dǎo)的人類代謝紊亂。

圖7 | 胰腺β細胞中受干擾的代謝物與糖尿病相關(guān)的尿代謝生物標志物的相關(guān)性

8、繪制 Cd 暴露對 TCA 循環(huán)和甘油磷脂代謝的破壞性影響

為了解釋顯著擾動的代謝物與代謝途徑之間的關(guān)系，作者根據(jù)擾動的代謝物數(shù)據(jù)和在 MIN6 細胞和小鼠胰腺中的驗證，繪制了圖 8中 Cd 暴露對線粒體 TCA 循環(huán)和甘油磷脂代謝的破壞性影響。Cd 暴露擾亂了 TCA 循環(huán)代謝物，顯著增加糖酵解/糖異生和?；撬岽x的紊亂。此外，還發(fā)現(xiàn)甘油磷脂代謝的代謝產(chǎn)物的增加，鞘脂代謝代謝物的減少?？傊k誘導(dǎo)的線粒體 TCA 循環(huán)和甘油磷脂代謝紊亂可能是胰腺 β 細胞功能障礙的潛在機制。

圖8 | 胰腺β細胞中受干擾的代謝物與糖尿病相關(guān)的尿代謝生物標志物的相關(guān)性

相關(guān)討論

由于環(huán)境因素和遺傳脆弱性，糖尿病的風險被認為是頻率上升的。作為環(huán)境中最危險的因素之一，Cd 被發(fā)現(xiàn)在肝臟和胰腺中積聚，在那里它對碳水化合物代謝產(chǎn)生有害影響并破壞葡萄糖穩(wěn)態(tài)。鎘暴露還會通過改變和損害相關(guān)的關(guān)鍵酶活性來干擾糖酵解、糖生成和糖異生過程，失調(diào)激素平衡，如胰島素、糖皮質(zhì)激素和胰腺和腎上腺中的兒茶酚胺。此外，鎘暴露增強了活性氧的產(chǎn)生并抑制了多個器官之間的抗氧化防御機制。盡管大量研究支持鎘誘導(dǎo)的代謝紊亂與糖尿病發(fā)病率之間的關(guān)聯(lián)，但這種代謝毒性的確切機制仍然未知。

在作者的研究中，將基于 LC-MS/MS 的非靶向代謝組學分析應(yīng)用于 Cd 暴露的 MIN6 細胞，以深入了解代謝組水平的代謝變化。證明了與環(huán)境相關(guān)的 Cd 暴露改變了 MIN6 細胞中的代謝組學特征，這些數(shù)據(jù)表明，受擾動的代謝物可能直接損害這些細胞器的功能并且細胞器之間的代謝相互作用受到干擾。此外，Cd 暴露導(dǎo)致脂毒性代謝物強度顯著增加。KEGG 通路分析顯著揭示了 Cd 暴露破壞了以線粒體 TCA 循環(huán)和甘油磷脂代謝紊亂為特征的代謝平衡。據(jù)作者所知，這是第一項描述胰腺 β 細胞中鎘毒性的代謝組學特征并將代謝組學特征與鎘誘導(dǎo)的人體代謝毒性相關(guān)聯(lián)的研究。

流行病學研究已經(jīng)建立了鎘暴露與糖尿病之間的直接聯(lián)系。Cd 毒性對糖脂代謝的確切機制尚未闡明。由于胰腺 β 細胞是體內(nèi)產(chǎn)生和分泌胰島素的唯一來源，揭示胰腺 β 細胞中全代謝組水平的 Cd 誘導(dǎo)的代謝紊亂對于了解 Cd 暴露與糖尿病風險增加之間的關(guān)系具有重要意義。從這個意義上說，結(jié)合生物信息學分析的非靶向代謝組學的應(yīng)用可能是揭示鎘誘導(dǎo)的胰腺β細胞代謝毒性特征的有力策略。代謝組學的主要價值在于它測量代謝物并確定在短時間內(nèi)整合基因表達和環(huán)境調(diào)節(jié)的途徑，以揭示系統(tǒng)的新興特性。

在作者目前的研究中，作者證明 Cd 暴露會誘導(dǎo)小鼠葡萄糖升高和不耐受，并抑制胰腺 β 細胞胰島素的產(chǎn)生。在作者的體外研究中，當 MIN6 細胞用與環(huán)境相關(guān)的 Cd 暴露，胰島素分泌明顯受到抑制。代謝組學分析分別鑒定了 76 種顯著擾動的代謝物。這些受干擾的代謝物影響胰腺 β 細胞功能的潛在機制需要進一步研究。

由于 Cd 暴露會導(dǎo)致 TCA 循環(huán)和受擾動的代謝物表明的甘油磷脂代謝的擾動，作者確定了與這些代謝過程相關(guān)的酶的基因表達的變化。在鎘暴露后，在 MIN6 細胞和小鼠胰腺中，TCA 循環(huán)相關(guān)基因，脂質(zhì)代謝相關(guān)基因紊亂。因此，作者目前的研究結(jié)果支持 Cd 誘導(dǎo)的酶失調(diào)導(dǎo)致 TCA 循環(huán)和甘油磷脂代謝紊亂的推測。

因此，作者提出的新發(fā)現(xiàn)對于全面了解環(huán)境相關(guān) Cd 暴露的代謝毒性和確定早期醫(yī)療干預(yù)的分子靶點具有非常寶貴的價值。

小鹿推薦

本研究中的代謝組學分析不僅在胰腺 β 細胞中進行，而且在 Cd 暴露工人的尿液樣本中進行。細胞代謝組學的結(jié)果揭示了與環(huán)境相關(guān)的 Cd 暴露如何在整個代謝組水平上發(fā)揮代謝毒性。盡管人類尿液代謝物的變化不一定反映胰腺 β 細胞功能障礙，但尿液中存在擾動的代謝物為將鎘暴露的代謝毒性與人類健康風險聯(lián)系起來提供了直接證據(jù)。揭示了闡明受干擾的代謝物和代謝途徑與鎘暴露相關(guān)糖尿病發(fā)病機制的動態(tài)作用。

作者首先進行了體內(nèi)研究，以研究鎘誘導(dǎo)的小鼠血糖水平、血清胰島素水平、葡萄糖耐量和胰腺胰島素產(chǎn)生的變化。為了剖析 Cd 毒性的代謝組學特征，作者使用體外Cd 暴露的胰島素分泌細胞和來自 Cd 暴露工人的尿液樣本，通過非靶向代謝組學探索代謝組范圍內(nèi)的變化。通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 測定代謝物強度和變化特征。作者分析了改變代謝物的細胞內(nèi)位置，確定了脂毒性代謝物并描繪了 Cd 干擾的代謝途徑。鎘暴露工人尿液中的代謝組學變化進一步證實了鎘在胰腺 β 細胞中誘導(dǎo)的代謝毒性。本研究的結(jié)果提高了作者對胰腺 β 細胞和人類全代謝組水平上鎘誘導(dǎo)的代謝毒性的理解。本篇文章是一篇思路非常清晰的代謝組+轉(zhuǎn)錄組文章，值得深入研讀。

浙江大學公共衛(wèi)生學院博士洪慧慧為論文第一作者，浙江大學公共衛(wèi)生學院周舟研究員、醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院急診科陸遠強教授和陸軍軍醫(yī)大學皮會豐教授為論文的共同通訊作者。

該研究受到了國家自然科學基金、教育部電磁輻射醫(yī)學防護重點實驗室開放課題以及浙江省重點實驗室建設(shè)基金的支持。

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