期刊：Immunity ?43.47分

技術(shù)：?jiǎn)渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；單細(xì)胞VDJ測(cè)序；bulk 5’RNA測(cè)序；空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；多重免疫熒光

導(dǎo)語

目前有初步研究表明腫瘤內(nèi)三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structures，TLS）和患者的良好預(yù)后以及癌癥免疫療法響應(yīng)相關(guān)。也有文獻(xiàn)研究表明TLS的作用機(jī)制和B細(xì)胞的免疫響應(yīng)有關(guān)，但二者作用方式尚不明確。因此，本文使用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)來檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）中TLS和B細(xì)胞關(guān)系。結(jié)果顯示B細(xì)胞在TLS中富集，并且證實(shí)在TLS中B細(xì)胞逐漸向漿細(xì)胞轉(zhuǎn)變（plasma cell，PC）。分析顯示TLS中免疫細(xì)胞展示更多的克隆多樣性，選擇性和擴(kuò)展性。在TLS+腫瘤中，PC會(huì)分泌更多IgG和IgA，且沿成纖維細(xì)胞軌道分布在腫瘤內(nèi)部。IgG和惡性腫瘤細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)，預(yù)示TLS參與抗腫瘤效應(yīng)，并且和免疫治療有效響應(yīng)相關(guān)。

研究結(jié)果

1. 空間轉(zhuǎn)錄組分析腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）架構(gòu)揭示TLS+腫瘤中富集B細(xì)胞

為了分析TLS對(duì)TME整體結(jié)構(gòu)的影響，實(shí)驗(yàn)人員使用了來自10×Genomic的空間轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)品Visium。在24 例ccRCC原發(fā)腫瘤上進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組，分別為新鮮組織的冷凍包埋樣本（fresh frozen，F(xiàn)F，n = 12）和FFPE樣本（n = 12）。每個(gè)腫瘤組織TLS的定位由訓(xùn)練有素的病理學(xué)家注釋分段并通過H＆E染色后呈現(xiàn)（圖1A）。圖1分別展示了冰凍包埋樣本TLS+腫瘤（圖1A -1C）；FFPE樣本TLS+腫瘤（圖1D -1F）；和冰凍包埋樣本TLS-腫瘤（圖1G -1H -1I）。通過對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，在TLS結(jié)構(gòu)中B細(xì)胞系、單核細(xì)胞系、纖維細(xì)胞的標(biāo)志物檢出率高，但是中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物則相反，而冰凍包埋樣本和FFPE樣本針對(duì)以上結(jié)論一致。

2. 免疫球蛋白（Ig）對(duì)應(yīng)基因在TLS中的表達(dá)情況

為了進(jìn)一步確定TLS在腫瘤中的轉(zhuǎn)錄特征，結(jié)合H&E，免疫熒光（CD3/CD20/PD-1），免疫組化（CD3/CD20）等標(biāo)簽分別對(duì)冰凍包埋組織和FFPE組織進(jìn)行區(qū)域劃分，根據(jù)劃分好的區(qū)域進(jìn)行TLS和腫瘤區(qū)域間轉(zhuǎn)錄組差異基因的對(duì)比。AUC達(dá)到0.7且至少出現(xiàn)3例TLS+腫瘤的基因作為TLS特征，篩選了29個(gè)基因作為TLS分子標(biāo)志物，該分子特征包括12個(gè)免疫球蛋白基因（IGHA1, IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHG4, IGHGP, IGHM, IGKC, IGLC1, IGLC2, IGLC3, and JCHAIN）， 5個(gè)B細(xì)胞分子標(biāo)記（CD79A, FCRL5, MZB1, SSR4和XBP1）， 2個(gè)T細(xì)胞標(biāo)記?（TRBC2 和 IL7R），2個(gè)成纖維細(xì)胞標(biāo)記物（CXCL12, LUM)），2個(gè)補(bǔ)體蛋白編碼基因（C1QA和C7）， 除此外還有基因：CD52、APOE、PTLP、PTGDS、PIM2和DERL3。這29個(gè)基因的標(biāo)記，可以作為TLS的分子標(biāo)志物，?標(biāo)志物在冷凍樣本（AUC：0.89 - 0.97）和FFPE樣本（AUC:0.75 - 0.93）中均呈現(xiàn)出TLS特異性（圖2F-2H）。值得注意的是，TLS雖然富集B細(xì)胞標(biāo)志物，但是初始B細(xì)胞相關(guān)的表達(dá)缺乏（圖2D）；而FCRL4+記憶B細(xì)胞(p = 2e-16)，發(fā)生中心B細(xì)胞(p = 0.0087)和漿母細(xì)胞(p = 2e-16)相關(guān)表達(dá)比較高。

3. 空間之別B細(xì)胞受體(BCR)分析原位高頻克隆型

本文使用了開源的分類工具M(jìn)iXCR，從bulk 5’RNA測(cè)序數(shù)據(jù)以及Visium 3’RNA 數(shù)據(jù)中分析BCR中的 IgL和IgH克隆型及其胚系軀體細(xì)胞的超頻突變。這些數(shù)據(jù)能夠獲得足夠長(zhǎng)度的mRNA轉(zhuǎn)錄本，以覆蓋大多數(shù)IGL和一些IGH序列及其完整互補(bǔ)決定區(qū)域（CDR）3。在TLS區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了數(shù)量占比最多的輕鏈克隆型（圖3A）。通過測(cè)量輕鏈序列中V區(qū)突變數(shù)與胚系V區(qū)基因進(jìn)行比較，從而評(píng)價(jià)B細(xì)胞的成熟程度。輕鏈V基因突變中位數(shù)在TLS區(qū)域顯示低至中位水平，而在腫瘤區(qū)域遠(yuǎn)離TLS的位置顯示比較多高突變序列（圖3B）。但是從全長(zhǎng)角度考察TLS區(qū)域有比較高的突變率，且主要為軀體細(xì)胞突變（圖3C）。就TLS占比進(jìn)行對(duì)比，TLS占比高的腫瘤組織的其高頻突變更多，無論是VL區(qū)域基因（TLS高-中位數(shù)= 12個(gè)突變，TLS低-中位數(shù)= 8個(gè)突變，p = 0.0163）還是VH區(qū)域基因（TLS高-中位數(shù)= 19個(gè)突變，TLS低-中位數(shù)= 13.5個(gè)突變，p= 0.0227）（圖3D）。

根據(jù)bulk 5’RNA-seq結(jié)果，除了突變頻率更高，TLS占比高的樣本其整體克隆型的種類多，且克隆型的數(shù)量大。為了分析克隆型間的關(guān)系并對(duì)其進(jìn)行可視化，根據(jù)VH-CDR3序列進(jìn)行計(jì)算并用環(huán)形樹狀圖展示，對(duì)于TLS+腫瘤（id: b_1）。一共有31個(gè)克隆家族，其中2 ~ 16分別只識(shí)別出唯一克隆型（圖3F）。而在個(gè)別家族中，有些克隆型可以被檢測(cè)到80次，甚至20次（圖3F）。通過Visium結(jié)果證明TLS附近聚集的是同一個(gè)克隆家族，而在TLS遠(yuǎn)處稀疏散布，主要展示的是IgH家族1群和3群(圖3G)。

4. 漿細(xì)胞從TLS沿成纖維細(xì)胞軌跡傳播

為了分析腫瘤內(nèi)漿細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的位置以及原位CXCL12（細(xì)胞趨化因子）的表達(dá)，本文使用多重免疫熒光標(biāo)記FFPE腫瘤切片，利用作為漿細(xì)胞標(biāo)記物（MUM1和IRF4）和成纖維細(xì)胞標(biāo)志物COL1 (Col1a)加以區(qū)分。TLS區(qū)域利用CD3/CD20顯色標(biāo)記（圖4A），可以看到MUM1+?IgG+漿細(xì)胞和少量MUM1+?IgA+漿細(xì)胞這兩種雙陽的漿細(xì)胞分布在TLS區(qū)域。同時(shí)在區(qū)域上COL1+/CXCL12+成纖維細(xì)胞在這些區(qū)域與MUM1+?漿細(xì)胞定位相同（圖4B）。此外，漿細(xì)胞沿著沿著成纖維細(xì)胞的軌跡分布，漿細(xì)胞分布上嵌入 COL1+?CXCL12+成纖維細(xì)胞構(gòu)成的網(wǎng)格中，且主要在TLS的遠(yuǎn)端(圖4C)。

從放大的圖片觀察如圖4所示，以細(xì)胞核檢測(cè)定位來判斷COL1+成纖維細(xì)胞定位（圖4D-4E-4H-4I）。絕大多數(shù)的漿細(xì)胞都非常貼近成纖維細(xì)胞核的位置。從展示的兩例腫瘤組織來看，平均距離分別為17.5 μm和19 μm，其距離分布如圖4G和4K所示。同時(shí)也針對(duì)其余在44個(gè)腫瘤樣本上進(jìn)行測(cè)量，其平均距離為25.7 μm的距離（圖4L）。

5. TLS和分泌IgG的漿細(xì)胞參與腫瘤細(xì)胞調(diào)亡過程，并影響免疫療法療效

利用多色熒光標(biāo)記FFPE腫瘤組織中未成熟TLS，CD20+?B細(xì)胞（綠色），CD23+濾泡樹突狀細(xì)胞（紅色），BCL6+?發(fā)生中心B細(xì)胞（白色），PNAd+?高內(nèi)皮小靜脈（黃色）（圖5A）。為了進(jìn)一步研究TLS與腫瘤內(nèi)漿細(xì)胞的關(guān)系，首先需要分析TLS成熟度。成熟的 TLS的特征：發(fā)生中心（germinal center，GC）包含一個(gè)被T細(xì)胞包裹的B細(xì)胞區(qū)域，其中包括了CD4+?PD1+?T細(xì)胞，CD4+?PD1+CXCR5+?Tfh細(xì)胞和分泌CXCL13的細(xì)胞（圖5B）。GC區(qū)域具體細(xì)胞分布特征：CD23+濾泡樹突狀細(xì)胞（FDC）， BCL6+?CD20+?B細(xì)胞，分布邊緣的PNAd+高內(nèi)皮小靜脈（圖5C）。結(jié)合Ig相關(guān)的檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示腫瘤中TLS的存在與MUM1+?IgG+的分泌密度之間存在顯著的正相關(guān)（圖5D）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)含有TLS的CD23+?FDC、BCL6+細(xì)胞、PNAd+?高內(nèi)皮小靜脈三者與MUM1+IgG+?漿細(xì)胞和MUM1+IgA+?漿細(xì)胞密度之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性（圖5E）。

值得注意的是，以CAIX+作為腫瘤細(xì)胞膜的標(biāo)記，在TLS+腫瘤能觀察到IgG，但是在TLS-中沒有觀察到（圖6A）。隨后在103例腫瘤組織中檢測(cè)，結(jié)果顯示TLS+的腫瘤中IgG的檢出率到100%，二者的正向相關(guān)性與和TLS-的腫瘤對(duì)比達(dá)到顯著差異（p=0.0046）（圖6B）。此外，發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞IgG標(biāo)記和腫瘤中浸潤(rùn)的MUM1+IgG+漿細(xì)胞有顯著性正相關(guān)（中位IgG標(biāo)記MUM1+IgG+高腫瘤= 80%，和MUM1+IgG+低腫瘤= 40%，p =0.000195）（圖6C），而IgA和IgG的表達(dá)趨勢(shì)一樣但是IgA本身的表達(dá)量比較低（圖6D）。為了揭示腫瘤結(jié)合IgG抗體的作用，本文還針對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的現(xiàn)象進(jìn)行研究， 通過細(xì)胞調(diào)亡典型形態(tài)學(xué)改變?nèi)缂?xì)胞核變大等， 并且使用cleaved caspase 3作為調(diào)亡的蛋白標(biāo)志物。圖 6E表明cleaved caspase 3主要在TLS+的腫瘤中。而cleaved caspase 3高表達(dá)的區(qū)域同時(shí)伴隨IgG的表達(dá)，二者的染色重疊覆蓋度達(dá)到60%（圖6E和6F）。除了以上的共定位結(jié)果，通過免疫熒光標(biāo)記也發(fā)現(xiàn)CD68+巨噬細(xì)胞也會(huì)聚集到以上的產(chǎn)生調(diào)亡的腫瘤細(xì)胞附近（圖6G）。

為了檢測(cè)IgG對(duì)于接收免疫抑制劑療法患者的影響，采集了患者的信息，并且選擇IgG 60%作為分界點(diǎn)，對(duì)患者隊(duì)列進(jìn)行分類。結(jié)果顯示高表達(dá)IgG的患者PFS更長(zhǎng)(中位數(shù) PFS = 16.3月vs 6.4月, p=0.039)（圖6H和6I）；而這群高表達(dá)IgG的患者中針對(duì)免疫療法的客觀響應(yīng)率（objective responses,OR ）也更高（圖6J）。

參考文章：

Meylan M, Petitprez F, Becht E, et al. Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer.?Immunity. 2022;55(3):527-541.e5. doi:10.1016/j.immuni.2022.02.001