一、 概念及應用

轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA、RNA等導入真核細胞的技術?；蜣D(zhuǎn)染技術不僅是研究轉(zhuǎn)基因和基因表達的重要

工具，也是目前基因治療的關鍵步驟。理想的基因轉(zhuǎn)染試劑應該具有如下特點:高效轉(zhuǎn)染:安全;低細胞毒性;

方法簡單:省時、經(jīng)濟。

?二、分類

?1、瞬時轉(zhuǎn)染，外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72 小時內(nèi)分析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。

2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體存在。盡管線性DNA 比超螺旋DNA 轉(zhuǎn)入量低，但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細胞能整合，通常需要通過一些選擇性標記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶(APH:新霉素抗性基因)，潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH)，胸苷激酶

(TK)等反復篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細胞系。

?三、影響轉(zhuǎn)染效率的因素

1.細胞培養(yǎng)物

轉(zhuǎn)染時要求細胞代次不能太高(<50)，且最好處于對數(shù)期，生長旺盛。同時還需要一定的細胞密度，一般貼壁細胞鋪板密度建議在70-90%，懸浮細胞鋪板密度在2-4x100/ml細胞培養(yǎng)物一定要避免細菌，支原體或直菌的污染。

2. 血清

大多數(shù)培養(yǎng)基在使目前需要加而清，而清質(zhì)量的變化自接影響轉(zhuǎn)染效率，有些轉(zhuǎn)染技術，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在情況下效率很低，因此在轉(zhuǎn)染前要去除血清。對于RNA轉(zhuǎn)染，如何消除血清中潛在的RNase 污染是值得關注的。3 抗生素

培養(yǎng)基中添加的抗生素一般對于真核細胞無毒，但有些轉(zhuǎn)染試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞。這可能間接導致細胞死亡，造成轉(zhuǎn)染效率低。

4.載體構建

轉(zhuǎn)染載體的構建(病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等)也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果，載體的形態(tài)及大小對轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響，如前面提到的超螺旋及線性DNA對瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對細胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進行。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最好選擇誘導型啟動子，對于瞬時轉(zhuǎn)染可選擇組成型啟動子。

?5.DNA質(zhì)量

DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(如脂質(zhì)體等)基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉(zhuǎn)染復合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進行。此外，對一些內(nèi)毒素敏感的細胞(如原代細胞，懸浮細胞和造血細胞)，應利用除內(nèi)毒素污染的質(zhì)粒抽提試劑盒以保證理想的轉(zhuǎn)染效果。

6.轉(zhuǎn)染技術

目前的轉(zhuǎn)染技術主要有磷酸鈣法，陽離子脂質(zhì)體，陽離子聚合物等，根據(jù)各方法的利弊選擇一種合適的轉(zhuǎn)染技術，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例。

和元李記（生物） EZ Trans Plus 細胞轉(zhuǎn)染試劑