期刊：Nat Genet（IF=41.307）

技術：scRNA-seq、空轉

導語

乳腺癌是復雜的細胞生態(tài)系統(tǒng)，其中異型相互作用在疾病進展和對治療的反應中起著核心作用。對它們的細胞組成和組織的了解仍然有限。對人類乳腺癌的單細胞和空間分辨轉錄組學分析，并開發(fā)了一種內在亞型分類(scSubtype)的單細胞方法來揭示復發(fā)性腫瘤細胞的異質性。

使用CITE-Seq進行免疫分型可提供高分辨率的免疫圖譜，包括與臨床結果相關的新型PD-L1/PD-L2+巨噬細胞群。利用單細胞特征，將其分層為9個簇，稱為“生態(tài)型”，具有獨特的細胞組成和臨床結果。這項研究提供了乳腺癌細胞結構的全面轉錄圖譜。

研究結果

1. 人類乳腺癌的高分辨率細胞圖

對26個原發(fā)性治療前腫瘤（11個ER+，5個HER2+和10個TNBC）進行scRNA-Seq。總共有130,246個細胞通過了質控，對這些細胞進行了聚類和注釋。主要的細胞類型在所有腫瘤和臨床亞型中都有體現(xiàn)。UMAP顯示上皮細胞被腫瘤清晰分離，這些細胞被鑒定為正常的乳腺上皮細胞，而腫瘤間質和免疫細胞聚集在一起。由于乳腺癌在很大程度上是由DNA拷貝數(shù)變化驅動的，我們使用InferCNV來區(qū)分腫瘤和正常上皮細胞。在腫瘤人群中，觀察到大量的大規(guī)?；蚪M重排，這揭示了患者特有的拷貝數(shù)變化和乳腺癌中常見的拷貝數(shù)變化。

2. scSubtype：scRNA-Seq數(shù)據的內在子類型

使用1,100個乳腺腫瘤的TCGA數(shù)據集對偽散裝樣本進行分層聚類。最終確定4組基因，這些基因將定義單細胞衍生的分子亞型。

scSubtype結果顯示，13/20的樣本中有不到90%的腫瘤細胞屬于一種分子亞型，而只有一種腫瘤(CID3921;HER2E)表現(xiàn)為完全同質的分子亞型。在一些管腔和HER2E腫瘤中，scSubtype預測了少量基底樣細胞，在2例ER+病例中通過免疫組化驗證了這一點，在其他ER+腫瘤細胞中，ER陰性，基底細胞標志物細胞CK5陽性的形態(tài)學惡性細胞呈小袋狀?；蚣患_定了這些轉基因基因共享和不同的功能特征，這與臨床IHC結果一致。

3. 復發(fā)基因模塊驅動腫瘤細胞異質性

對至少50個腫瘤細胞進行整合聚類，生成574個ITTH基因標記，并識別出七個群體，即“基因模塊”（GMs）?；蚣患b定出這些GMs共有的和獨特的功能特征。對于每個腫瘤細胞，計算了7個GMs的特征評分，并使用層次聚類來識別細胞相關性。這清楚的將腫瘤細胞進行了分組，減少了巨大腫瘤間變異性。一些模塊與SCSubtype相關聯(lián)，而其他模塊則顯示了更多樣化的子類型關聯(lián)。最后，使用基于GM的細胞狀態(tài)分配來了解腫瘤細胞的瘤內異質性。類似于SCSubtype，看到了與腫瘤亞型廣泛一致但不受腫瘤亞型限制的細胞異質性證據。scSubtype和GM分析為腫瘤性ITTH的分類提供了互補的新方法，并進一步證明大多數(shù)腫瘤中癌細胞表現(xiàn)出不同的表型。

4. 淋巴細胞和先天淋巴細胞

從患者中鑒定出了8個T細胞和先天淋巴細胞簇。在TNBC樣本中，IFITl/c6、LAG3/c8 和MKI67/C11的T細胞比例更高。在TNBC中CD8亞群顯著表達PD-1、LAG3、CD27和CD70配受體，可增強T細胞的細胞毒性。在不同的臨床亞型中，檢查點分子表達的差異更為明顯，包括在非免疫細胞(如CAFs)上。這些數(shù)據提供了對每種亞型疾病最適合的免疫治療策略的見解。

5. 髓系細胞

髓系細胞共聚類成13個cluster，可在所有腫瘤中以不同頻率被識別。單核細胞形成3個cluster，巨噬細胞形成6個cluster，其中一個簇具有先前“M1-like”表型相關的特征，還有兩個簇類似于“M2-like”表型，所有這些cluster都與之前在乳腺癌中描述的TAMs有一些相似之處。這些細胞與最近報道的脂質相關巨噬細胞(LAMs)在肥胖小鼠和人類中擴增的轉錄組相似性非常高。雖然RNA編碼PD-L1和PD-L2在Mac:CXCL10和DCLAMP3髓系細胞中高度共表達，但CITE-seq 數(shù)據的分析顯示，PD-L1和 PD-L2蛋白表達在Mac:CXCL10、LAM1:FABP5、LAM2:AP0E和DC:LAMP3簇中分布更廣，突出LAM1/2作為免疫調節(jié)分子的重要來源。

6.?基質亞類表現(xiàn)出不同的分化狀態(tài)

在間質室中共發(fā)現(xiàn)了三種主要的細胞類型（CAFs、PVL和內皮細胞）。擬時序分析揭示了五種CAF狀態(tài)；PVL細胞分出了三種類型；內皮細胞也被分成了三種類型。相似的CAF、PVL和內皮細胞狀態(tài)在臨床亞型和三個正常乳腺組織樣本中被發(fā)現(xiàn)，這表明它們可能是在TME中進行重塑的駐留細胞類型。

7.?乳腺癌異質性的空間映射

對6個樣本（2個ER+和4個TNBC）進行了空間轉錄組分析，并將其與scRNA-seq數(shù)據進行了匹配分析。對所有癌癥位置基因模塊計算了得分之間的Pearson相關性。這揭示了在所有6個病例中大多數(shù)保守的兩個主要群集，包括GM1、GM3、GM5和GM6在一個群集中，GM2和GM4在另一個群集中，GM3 (EMT, IFN, MHC)和GM4(增殖)在所有樣本中都表現(xiàn)出很強的負相關，這表明這些不同的癌癥表型發(fā)生在乳腺癌相互排斥的區(qū)域。

8.?映射新的異型細胞相互作用

在6例病患中發(fā)現(xiàn)5例肌成纖維細胞樣CAFs和iCAFs 之間存在中度負相關性。CAF定位在7個HER2+乳腺腫瘤的獨立空間轉錄組數(shù)據是一致的，表明這種關系在不同的臨床亞型中是保守的。在兩項研究中，iCAFs均與多個淋巴細胞群體共定位。在6個樣本中，肌成纖維細胞樣CAFs與CD8+T細胞相關，揭示與高TIL浸潤或免疫炎癥表型的浸潤性乳腺癌的功能相關。巨噬細胞的LAM1和LAM2細胞均存在于浸潤性腫瘤區(qū)域；然而，LAM2也存在于高基質細胞、脂肪細胞和淋巴細胞的形態(tài)學區(qū)域。在所有三個亞型的8個腫瘤中，LAM2細胞與CD4+和CD8 + T細胞正相關。多個腫瘤的LAM2細胞和CD4+/CD8+T細胞富集的spots共同表達PD-L1/PD-1和PD-L2/PD-1，表明這些細胞可能具有免疫調節(jié)的功能相關性。

8.?乳腺癌生態(tài)型與患者生存相關

9個細胞組成相似的腫瘤簇與腫瘤亞型、sc亞型細胞和主要細胞類型的多樣性相關。Ecotype 3（E3）在含有Basal_SC等細胞和基底樣PAM50亞型的腫瘤中富集。El、E5、E6、E8和E9主要由管腔細胞組成。E4對與抗腫瘤免疫相關的免疫細胞高度富集。E2 主要由 LumA 和正常樣腫瘤組成。

在預后方面，E2腫瘤患者預后最好，E3腫瘤患者5年生存率較差，這與已知的基底樣和高增殖腫瘤的不良預后相一致。E7預后也較差，以HER2E腫瘤為主；E4 也有相當大的比例HER2E和基底樣腫瘤，但這些患者的預后明顯好于E7，可能是抗腫瘤免疫細胞浸潤的結果。通過對整合基因組群與生態(tài)型之間的關聯(lián)性進行研究，發(fā)現(xiàn)E3中來自整合基因組群10的癌癥比例很高，5年生存率同樣很低。E7有很高比例的ERBB2擴增和HER2E整合基因組簇5。然而大多數(shù)生態(tài)型與特定的整合基因組簇或PAM50亞型沒有明確的關聯(lián)，這反映了基質細胞和免疫細胞在生態(tài)型中的作用。

參考文章：

Wu SZ, Al-Eryani G, Roden DL, Junankar S, Harvey K, Andersson A, Thennavan A, Wang C, Torpy JR, Bartonicek N, Wang T, Larsson L, Kaczorowski D, Weisenfeld NI, Uytingco CR, Chew JG, Bent ZW, Chan CL, Gnanasambandapillai V, Dutertre CA, Gluch L, Hui MN, Beith J, Parker A, Robbins E, Segara D, Cooper C, Mak C, Chan B, Warrier S, Ginhoux F, Millar E, Powell JE, Williams SR, Liu XS, O'Toole S, Lim E, Lundeberg J, Perou CM, Swarbrick A. A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers. Nat Genet. 2021 Sep;53(9):1334-1347. doi: 10.1038/s41588-021-00911-1. Epub 2021 Sep 6. PMID: 34493872; PMCID: PMC9044823.