蛋白質(zhì)樣品的制備 學(xué)習(xí)筆記
蛋白樣品的制備是WB實(shí)驗(yàn)的第一步，也是非常關(guān)鍵的一步，做好WB的前提是提取出質(zhì)量好的蛋白質(zhì)，這樣才能跑出美觀又可靠的條帶。不同樣本提取蛋白的方法不同——譬如血液、消化液和分泌液等體液中的可溶性蛋白質(zhì)可不經(jīng)抽提直接分離；而胞內(nèi)蛋白的抽提則需先將細(xì)胞膜或細(xì)胞壁破碎后用適當(dāng)溶劑將蛋白質(zhì)溶出，再用離心法除去不溶物得到抽提液。下圖簡(jiǎn)單概括了嚴(yán)格意義上動(dòng)物蛋白抽提的步驟：
蛋白質(zhì)的提?。ū戏乐沟鞍琢呀猓?/strong>
1. 單層貼壁細(xì)胞
（i）吸去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，加入預(yù)冷PBS緩沖液洗3次；
（ii）將適量裂解液（RIPA+蛋白酶抑制劑+磷酸酶抑制劑+PMSF）均勻加入培養(yǎng)皿表面；
（iii）冰上裂解適當(dāng)時(shí)間后將裂解的細(xì)胞用細(xì)胞刮棒刮下，然后用移液槍將細(xì)胞碎片和裂解液轉(zhuǎn)移入離心管內(nèi)（刮完馬上轉(zhuǎn)移），并反復(fù)吹打充分破碎細(xì)胞（吹打過(guò)程需避免反復(fù)打入氣泡；若實(shí)驗(yàn)條件允許可用超聲細(xì)胞破碎儀替代吹打）；
（iv）4℃離心取上清即為總蛋白。
2. 加藥物處理的貼壁細(xì)胞
由于受藥物影響，一些細(xì)胞脫落下來(lái)，故除按單層貼壁細(xì)胞操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。
（i）將培養(yǎng)液移入離心管內(nèi)離心適宜時(shí)間；
（ii）棄去上清后加PBS緩沖液吹打洗滌并離心，棄上清后用PBS再次洗滌；
（iii）用移液槍將上清充分吸去后加入裂解液并于冰上裂解適宜時(shí)間（裂解同單層貼壁細(xì)胞處理）；
（iv）將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混合，于4℃離心后取上清即為總蛋白。
3. 組織細(xì)胞
（i）取適量組織加入預(yù)冷裂解液后將組織盡量剪碎并用組織勻漿器勻漿；
（ii）冰上靜置適宜時(shí)間（可間隔一段時(shí)間重復(fù)碾碎組織操作而使組織盡量碎裂）；
（iii）裂解完成后于4℃離心后收集上清即為總蛋白。
蛋白質(zhì)的定量——BCA法
（i）標(biāo)準(zhǔn)液制備：梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋白定量液（可用裂解液或PBS稀釋?zhuān)?，完成后置于冰上備用?strong>
（ii）BCA工作液制備：將A液和B液搖晃混勻，按照A液：B液=50:1的比例配置BCA工作液并充分混勻（BCA工作液室溫下24h內(nèi)穩(wěn)定，故需現(xiàn)用現(xiàn)配）；
（iii）加樣孵育：在96孔板中加入蛋白樣品或標(biāo)準(zhǔn)品后加入BCA工作液（推薦優(yōu)先加樣，再加工作液，以保證反應(yīng)完全），設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，充分混勻，注意盡量避免出現(xiàn)氣泡（若出現(xiàn)氣泡需除去氣泡避免影響測(cè)定），適宜溫度下孵育一段時(shí)間（需參考說(shuō)明書(shū)描述溫度和時(shí)間）。
（iii）測(cè)定：酶標(biāo)儀在指定波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算蛋白濃度。
原理：BCA法基于雙縮脲原理，堿性條件下蛋白質(zhì)中的肽鍵可將Cu2+還原成Cu+，BCA鰲合Cu+作為顯色劑產(chǎn)生藍(lán)紫色并在562nm有吸收峰，單價(jià)Cu+與蛋白質(zhì)呈劑量相關(guān)性，故可根據(jù)待測(cè)蛋白在562nm處的吸光度計(jì)算待測(cè)蛋白濃度。
WB用蛋白樣品的變性：
（i）計(jì)算上樣所需蛋白樣品體積與上樣緩沖液（升溫至體溫更利于取用，其取用體積通常為蛋白樣品體積的1/4）體積；
（ii）于各組蛋白上清樣品中分別補(bǔ)入相應(yīng)體積的上樣緩沖液并吹勻。
（iii）沸水變性后冷水冷卻，重復(fù)三次以保證蛋白樣品徹底變性（通?，F(xiàn)用現(xiàn)煮）。
（iv）變性后蛋白呈藍(lán)色均勻清亮透明液體，可稍離心后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
參考：
[1] 知乎-一站式：蛋白提取方法匯總
[2] 知乎-實(shí)驗(yàn)方法：組織蛋白提取及濃度測(cè)定（Tissue Proteins Extraction）
[3] 知乎-分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)｜細(xì)胞或組織總蛋白提取與濃度測(cè)定（BCA法）
[4] 知乎-生物小白的入門(mén)必修課——細(xì)胞總蛋白的提取
[5]?劉忠民，常曉彤. 臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 武漢：華中科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社, 2020.
[6] 葉棋濃.生物實(shí)驗(yàn)室系列 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與實(shí)驗(yàn)技巧[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社.2015.
[7] 馬文麗. 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M]. 北京：人民軍醫(yī)出版社, 2011.
[8] 鐘鼎生物-BCA法實(shí)驗(yàn)指南
