我不知道我的蛋白它有什么特性及其結(jié)構(gòu)？

1. 首先要確定一件事，那就是這幾個(gè)蛋白質(zhì)有人研究過(guò)沒(méi)有？還是最新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)？如果沒(méi)有人研究過(guò)，那就得 用先測(cè)部分氨基酸，然后設(shè)計(jì)引物克隆了。 2. 如果有人研究過(guò)，可以根據(jù)軟件來(lái)預(yù)測(cè)。如有swiss—pdb軟件，但這個(gè)是要有氨基酸序列，知道基因序列，可以在ncbi上進(jìn)行blastx，得到蛋白。

如何選擇蛋白表達(dá)宿主菌？

原核系統(tǒng)和真核細(xì)胞偏愛(ài)的密碼子有不同，因此，在用原核系統(tǒng)表達(dá)真核基因的時(shí)候，真核基因中的一些密碼子對(duì)于原核細(xì)胞來(lái)說(shuō)可能是稀有密碼子，從而導(dǎo)致表達(dá)效率和表達(dá)水平很低。 一般選擇菌主可看下表：

質(zhì)粒測(cè)序正確，蛋白無(wú)法表達(dá)

1. 分析一下稀有密碼子，如果比較多，可以嘗試rosetta（DE3） 2. 可能是基因本身的問(wèn)題。RNA3’的特殊結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)問(wèn)題，這種情況可以嘗試融合表達(dá)，譬如pET-32a。 3. 也許是表達(dá)量太低，也可以試一下western blot，定性的檢測(cè)一下。

如果IPTG誘導(dǎo)后細(xì)胞停止了生長(zhǎng)，是不是表示細(xì)胞死了？

T7 RNA聚合酶非常活躍，T7轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)極強(qiáng)，因此，一旦誘導(dǎo)，細(xì)胞的主要生理活動(dòng)都向著目的蛋白表達(dá)的方面轉(zhuǎn)化。在通常情況下，細(xì)胞將停止生長(zhǎng)，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成試驗(yàn)可以用來(lái)檢測(cè)表達(dá)系統(tǒng)的性 能。也有一些例外情況，例如特別的目的基因以及一些極為嚴(yán)緊的載體/宿主菌組合 （比如含有pLysE的宿主菌）等，這時(shí)在 誘導(dǎo)后菌落還是會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)。

如何提高重組蛋白在原核細(xì)胞里的表達(dá)水平，特別是可溶性表達(dá)？

這個(gè)問(wèn)題是最困擾做原核蛋白表達(dá)純化的人的。比如大腸桿菌表達(dá)蛋白本身表達(dá)量就大，但是表達(dá)的大都是包涵體，想要獲得可溶性蛋白，就需要做復(fù)性，或是再設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)就想辦法讓其在上清中表達(dá)。一般就要通過(guò)基因優(yōu)化，載體宿主優(yōu)化篩選，表達(dá)條件優(yōu)化，誘導(dǎo)條件優(yōu)化等等。 1. 降低重組蛋白合成的速率 可溶性蛋白的產(chǎn)率取決于蛋白的合成速率，蛋白的折疊速率，以及聚集的速率。高水平表達(dá)時(shí)，肽鏈聚集的速率一旦 超過(guò)折疊速率，就會(huì)形成包涵體。因此，降低重組蛋白合成的速率有利于提高重組蛋白的可溶性表達(dá)。 2. 密碼子優(yōu)化 密碼子優(yōu)化就是根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)密碼子的偏好性進(jìn)行優(yōu)化篩選。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的基因序列往往能提高mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn) 定性，有利于新生肽段的正確折疊，提高外源活性蛋白的表達(dá)。。 3. 表達(dá)溫度的選擇 大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度在37～39℃之間，但此溫度下極易生成包涵體蛋白，降低可溶性蛋白的表達(dá)，而低溫培養(yǎng)條 件下表達(dá)外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例。 4. 誘導(dǎo)條件優(yōu)化 搖瓶培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)選用低菌體濃度誘導(dǎo)，因?yàn)樵诘途鷿舛认戮w處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)活躍，有利于表達(dá)可溶性蛋白。 然而，如果能保證合理的補(bǔ)料與充分的通氣，在較高菌濃度下誘導(dǎo)也同樣可能獲得可溶蛋白的高效表達(dá)。在某些情況下，誘導(dǎo)劑的流加能顯著提高可溶蛋白的表達(dá)水平。

目的蛋白總是以不可溶的形式出現(xiàn)

在原核蛋白表達(dá)純化中目的蛋白經(jīng)常發(fā)生錯(cuò)誤的折疊，并聚集成為包涵體。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)，目的蛋白通常可達(dá)細(xì)胞總蛋白的50% 以上。雖然有一定比例的蛋白以可溶的單體形式存在，而多達(dá)95%（甚至更多）的蛋白則在包涵體中。實(shí)踐中，有很多實(shí)驗(yàn)室采取降低誘導(dǎo)溫度，例如25–30°C，或降低IPTG濃度(0.01–0.1mM)并延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間，還有采用特別的培養(yǎng)基等方法獲得 更多的可溶蛋白。然而，讓目的蛋白以包涵體形式聚集也并非總是壞事。不溶態(tài)在某些情況下非常有利： 1. 形成包涵體是目的蛋白表達(dá)量很高的表現(xiàn)。 2. 作為初步分離，將目的蛋白的包涵體純化出來(lái)非常簡(jiǎn)便。用核酸酶處理，并經(jīng)簡(jiǎn)單洗滌，通?？梢垣@得純度達(dá)75– 95%的目的蛋白。 3. 存在于包涵體中的目的蛋白通?？梢悦庥诘鞍酌傅乃馄茐淖饔?。 研究者采用下述方法加強(qiáng)蛋白重折疊的效果，并在很多蛋白上取得了好結(jié)果，可以嘗試以下：當(dāng)?shù)鞍走€結(jié)合在樹(shù)脂上時(shí)，使 用6M-8M梯度鹽酸胍、1mM還原型及0.2mM氧化型谷胱甘肽處理，繼而用咪唑正常洗脫。有些實(shí)驗(yàn)室在透析去除變性劑的 過(guò)程中加入底物或類似物，也有幫助酶折疊的效果。 德泰生物原核蛋白表達(dá)服務(wù)（http://www.detaibio.com/protein-bacterial.html）采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組蛋白生產(chǎn)，擁有超十年的蛋白表達(dá)經(jīng)驗(yàn)，已成功交付3000+組蛋白。客戶只需提供目標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)的基因或蛋白序列，同時(shí)提供相關(guān)要求即可。我們會(huì)按照合同約定的表達(dá)量、純度進(jìn)行交付。