引言

1955年Eagle博士發(fā)布細胞基礎培養(yǎng)基配方，并首次指出培養(yǎng)基是“一個包含無機鹽、氨基酸、糖、維生素及其他必須營養(yǎng)物的等滲透壓且具有pH緩沖能力的混合物”；1959年Eagle博士進一步改善了該配方，并將其命名為“Minimal Essential Medium (MEM)”。MEM培養(yǎng)基需要牛血清（10%以上）才能夠發(fā)揮作用。這在細胞培養(yǎng)基的研發(fā)歷史上，也是劃時代的里程碑事件！

無血清、化學成分限定培養(yǎng)基開發(fā)意義

當前，市場上做培養(yǎng)基的企業(yè)五花八門，既能保證細胞培養(yǎng)數(shù)量，又能保證細胞培養(yǎng)活力的培養(yǎng)基也有一些，但是大多含有血清，而這對于細胞成藥化和細胞大批量培養(yǎng)而言，又成為了一個巨大的門檻。如果細胞培養(yǎng)基含有外源血清的話，這對于后期的藥物申報會帶來不利影響。因為大批量培養(yǎng)的細胞，如果外源血清引入了病毒污染的話，這對企業(yè)將會帶來嚴重的質量事故，所以，無血清培養(yǎng)基的開發(fā)已經成為了細胞藥物研發(fā)企業(yè)和細胞庫運營企業(yè)亟需解決的重大挑戰(zhàn)！

無血清、化學成分限定的細胞培養(yǎng)基優(yōu)勢有：第一、增加確定性。生物實驗往往需要追根溯源，化學組分的限定能夠增加試驗的確定性，從而更受歡迎。第二、性能更一致。通過確定的配方，可以使每批產品質量得到保障，性能更一致。第三、容易進行純化和下游加工。部分含血清的培養(yǎng)基，純化工藝較為復雜。第四、提高制品穩(wěn)定性。成分的確定為培養(yǎng)基的儲存、運輸條件、保質期限帶來便利，提高了產品的穩(wěn)定性。多方面的優(yōu)勢，使得無血清、化學成分限定的培養(yǎng)基將成為未來主流的培養(yǎng)基。

293細胞應用領域

復雜的生物制藥產品生產嚴重依賴于哺乳動物細胞系，而HEK293因其高轉染率和在無血清懸浮培養(yǎng)環(huán)境中快速生長能力而被廣泛應用。主要體現(xiàn)在三個熱門方向：

①重組蛋白的生產。293真核表達系統(tǒng)可用于生產具有復雜翻譯后修飾的重組蛋白，生物活性更接近天然蛋白。

②病毒載體生產。HEK293常用于病毒載體的生產，由于在病毒載體生產過程中存在提供輔助功能的腺病毒E1A/B基因，因此將其用于腺病毒和腺相關病毒載體的生產，并且懸浮培養(yǎng)更能提高產量。

③腺病毒載體疫苗和溶瘤腺病毒的生產。由于AdVs和AAVs的產生需要HEK293細胞中腺病毒E1基因的反式互補，而人胚胎腎細胞HEK293又具有穩(wěn)定生長，高表達滴度病毒的優(yōu)勢，故HEK293細胞成為其選擇對象之一，以獲得較高的病毒滴度。

293細胞是腺病毒載體的包裝細胞，腺病毒是繼逆轉錄病毒和轉座子等用于細胞治療基因修飾的熱門載體。由于直接將腺病毒載體導入人體內表達目的基因，從而可以治療惡性腫瘤、心血管疾病及一些遺傳疾病。利用腺病毒載體在包裝細胞293中表達分泌性蛋白質，如蛋白酪氨酸、激酶IC等亦成為生產重組蛋白的其中一種途徑。

293細胞作用機理及培養(yǎng)手段

人胚胎腎細胞293的商品名為HEK293細胞，是一個由人胚胎腎細胞的細胞系傳代培養(yǎng)而來，目前在全球范圍內廣泛使用的一種經典細胞系，具有轉染效率高，易于培養(yǎng)等優(yōu)點。經過多年的傳代培養(yǎng)以后，它可細分為好幾種衍生株，其中293T/17細胞株的轉染效率更好，因此它也成為廣大科研工作者研究基因功能的常用工具。

293T細胞是293細胞通過基因技術派生出的細胞系，是經過腺病毒E1A基因的轉染，能表達SV40大T抗原，含有SV40復制起始點與啟動子區(qū)。許多真核表達載體如pcDNA3.1中含有SV40病毒的復制起始位點，可以在表達SV40病毒T抗原的細胞系中復制，從而提高外源基因的表達水平。因此293T細胞廣泛應用于病毒包裝，并且添加磷酸鈣以后能將轉染效率提高50%以上。在蛋白表達水平高的情況下，轉染后2-3天就可以通過堿性磷酸酶分析檢測到表達的蛋白。瞬時轉染293T細胞是過表達蛋白并獲得細胞內及細胞外（分泌的或膜）蛋白的便捷方式。293細胞在培養(yǎng)過程中的缺陷是生長過程中貼壁強度較少，在實驗過程中非常容易流失，從而影響實驗結果。因此，完善293細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術具有越來越重要的意義。哺乳細胞的大規(guī)模培養(yǎng)方式大致分為三種：貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)以及無血清懸浮培養(yǎng)。它在無Ca2+或含Ca2+培養(yǎng)基中及血清濃度降低的培養(yǎng)基中亦可同樣生長。如果一個實驗室所得到的293細胞是通過郵寄的方式獲取，并且細胞是存活在培養(yǎng)瓶中的情況。這就需要讓293細胞靜置一段時間，降低漂浮在培養(yǎng)液的細胞數(shù)量。

無血清懸浮培養(yǎng)作為一種人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產品質量，因此該方法正逐步成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究新方向。要實現(xiàn)293細胞無血清懸浮培養(yǎng)必須先將貼壁培養(yǎng)293馴化為懸浮培養(yǎng)293S細胞并尋找適合高密度無血清培養(yǎng)的培養(yǎng)液配方。懸浮培養(yǎng)時，由于缺少血清和蛋白的保護作用，293S對剪切力的敏感度增加，難以達到高密度培養(yǎng)，導致293S產生病毒的數(shù)量比貼壁培養(yǎng)低5-10倍左右。細胞接種后，灌流培養(yǎng)7天，達到細胞密度5×106/ml，即可實現(xiàn)增殖5-10倍。

AMMS??HEK293無血清培養(yǎng)基

隨著生物醫(yī)藥產業(yè)和生命科學基礎研究對動物細胞培養(yǎng)規(guī)模、效率和安全性能要求的不斷擴大和提高，對生產過程中培養(yǎng)基的使用要求越來越高。大部分生物制藥是利用哺乳動物細胞生產的，細胞培養(yǎng)技術是生物制藥生產工藝的核心技術，而細胞培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)的基礎，是生物制藥生產的關鍵原材料之一。人胚腎細胞系HEK293及其衍生細胞系，如293T細胞，293A細胞，293E細胞，293FT細胞等，被廣泛應用于多個領域，已成為一種強大的載體和新的平臺，用于生產蛋白質、基因治療的病毒載體、溶瘤細胞藥物、病毒樣顆粒疫苗、病毒載體疫苗等，而在細胞培養(yǎng)中化學成分限定的無血清培養(yǎng)基則是實際生產應用的首選。化學成分限定培養(yǎng)基有利于進行細胞培養(yǎng)的代謝及調控研究，也是工業(yè)生產抗體和重組蛋白的主流培養(yǎng)基。

一款真正化學成分限定培養(yǎng)基

同立海源AMMS??HEK293無血清培養(yǎng)基是一款用于 HEK-293 類細胞懸浮培養(yǎng)和轉染過程的無血清、無蛋白、無動物源的化學成分限定培養(yǎng)基。產品中含有 HEPES、碳酸氫鈉、氨基酸、維生素、酚紅、微量元素、Pluronicò F-68 等有利于 HEK293 類細胞 生長和表達的組分。產品在使用前需加入 L-谷氨酰胺一起使用。具有為廣大客戶增加實驗確定性、性能更一致等多方面的優(yōu)勢！

01、產品特點

?適用于 HEK-293 類細胞懸浮培養(yǎng)和轉染；

?無血清、無蛋白、無動物源，化學成分明確；

?質控嚴格，性能穩(wěn)定；

?ISO13485、ISO9001雙體系認證；

?推薦用于基因表達、蛋白生產和病毒類疫苗載體生產。

02、產品傳代方式

1.無需離心換液，可直接將細胞懸液依照所需比例加入培養(yǎng)液中；

2.傳代后的密度應控制在5-8×10^5 個/mL；

3.間隔1-2天需傳代一次（細胞密度最好不超過2×10^6）；

4.同時按比例加入L-Gln，使終濃度到4-6mM即可；

5.將搖瓶轉入二氧化碳培養(yǎng)搖床震蕩培養(yǎng)（培養(yǎng)條件：37℃、5%二氧化碳濃度、搖床120rpm）。

03、產品測評數(shù)據(jù)

圖1：細胞生長曲線對比測試

圖2：細胞活率曲線對比測試

圖3：不同抗體及蛋白表達對比

細胞培養(yǎng)基是以動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)為技術平臺，研發(fā)及生產生物藥品的關鍵原材料之一。生物工藝中細胞培養(yǎng)基的選擇要兼顧培養(yǎng)基使用性能、監(jiān)管合規(guī)、供應安全、下游純化工藝易行性及經濟成本等多層面要求。另外不管是選取哪種培養(yǎng)方式，最重要的一點是注意無菌操作，防止污染。其次在選擇293細胞適合的培養(yǎng)方式以及有利于其生長的培養(yǎng)基后，對細胞生長狀況實行有效監(jiān)控，以便獲得穩(wěn)定的蛋白或病毒產物。

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關于同立海源

北京同立海源生物科技有限公司，成立十余年專注細胞和基因治療（CGT）上游GMP級原料試劑研發(fā)，致力于為生命科學提供可靠的產品與服務。產品涉及真核重組蛋白、細胞分選試劑、無血清培養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)試劑盒、工具酶。為細胞和基因治療、mRNA開發(fā)、抗體藥物開發(fā)、細胞儲存等生物制藥和IVD領域提供核心原料試劑與服務。

公司建有符合cGMP標準的萬級潔凈車間，包括哺乳動物細胞表達蛋白質工程平臺、細胞培養(yǎng)技術開發(fā)平臺、體外診斷試劑生產平臺，通過ISO13485和ISO9001雙認證，部分產品已獲美國FDA DMF備案。