中醫(yī)藥是一種復(fù)雜干預(yù)的個體診療模式。近些年，圍繞著中醫(yī)藥重大科學(xué)問題、重大疾病以及科學(xué)研究，已經(jīng)開展了許多基礎(chǔ)研究。在今年3月舉辦的全國“兩會”上，全國人大代表、中國工程院院士、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院講席教授、生物芯片北京國家工程研究中心主任、博奧生物集團董事長兼總裁程京提出“引入人工智能等高科技手段，用于中醫(yī)藥創(chuàng)新研究”的建議，通過現(xiàn)代科學(xué)和人工智能技術(shù)建設(shè)一個非常龐大的數(shù)據(jù)庫，即中藥分子功能基因表達譜數(shù)據(jù)庫和分子本草智能組方系統(tǒng)（又稱為分子本草技術(shù)），可以系統(tǒng)評價中藥逆轉(zhuǎn)人體疾病分子信號通路的科學(xué)內(nèi)涵和創(chuàng)新中藥開發(fā)，有利于促進中醫(yī)藥科學(xué)化、數(shù)字化、智能化發(fā)展。

細胞作為生命最為基本的一個單元概念，是生命活動的基石。單細胞組學(xué)技術(shù)可通過極高的分辨率，精準識別每個細胞和細胞群所具有的分子特征，深度解析組織異質(zhì)性。高通量的單細胞測序技術(shù)一經(jīng)推出，便很快引爆了組學(xué)研究新時代。單細胞組學(xué)技術(shù)可以為揭示復(fù)雜疾病分子機制、闡明中醫(yī)藥作用機制帶來新的重大機遇。目前單細胞組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在中藥單體、復(fù)方治療疾病分子機制層面和中藥植物活體成分合成及轉(zhuǎn)運機制等方向獲得應(yīng)用，開展了許多卓有成效的基礎(chǔ)研究，取得了較大進展。

下面我們將分兩期分別介紹單細胞測序在中醫(yī)藥方向的應(yīng)用，來闡明單細胞組學(xué)技術(shù)是如何打開中醫(yī)藥療效和原理研究的“黑匣子”的。本篇我們來介紹單細胞中醫(yī)藥方向研究進展，下篇我們將總結(jié)單細胞測序技術(shù)在中醫(yī)藥方向可以解決的科學(xué)問題和應(yīng)用方向，為您帶來“兩桌”單細胞測序技術(shù)開展中醫(yī)藥學(xué)研究的“珍饈美味”。

01、中醫(yī)藥對疾病治療機制的單細胞組學(xué)研究進展

利用中藥單體和復(fù)方作用于小鼠疾病模型或各類細胞系，結(jié)合單細胞組學(xué)技術(shù)可以解析中藥治療疾病前后或不同階段免疫微環(huán)境的變化，識別不同細胞對藥物治療響應(yīng)的差異，發(fā)現(xiàn)對治療最敏感的細胞，發(fā)現(xiàn)中藥單體或復(fù)方影響的關(guān)鍵基因的表達，揭示藥物作用的靶點或關(guān)鍵通路。

2022年，Jin 等構(gòu)建了冠狀動脈結(jié)扎小鼠心肌梗死（MI）模型，選取 MI 后四個時間點（0、3、7 和 14 天）的小鼠心臟組織利用磁珠分選獲得 CD45+?細胞。這四個時間點涵蓋了心肌梗死發(fā)展的健康組織、早期急性炎癥期、中期修復(fù)期和晚期重塑階段四個階段，用來觀察炎癥細胞浸潤和心肌細胞纖維化的發(fā)展。該研究解析了免疫細胞在 MI 進展不同階段的變化，發(fā)現(xiàn)在 MI 后的第 3 天，巨噬細胞極速增加，體現(xiàn)了損傷后巨噬細胞在免疫反應(yīng)上發(fā)揮的巨大作用；在第 7 天，T、B 和中性粒細胞也逐漸增多，體現(xiàn)了淋巴細胞和粒細胞較慢但必要性的免疫應(yīng)答；14 天后，各類細胞表現(xiàn)出和假手術(shù)組（ Sham）基本一致的水平，體現(xiàn)出免疫細胞對損傷強大的修復(fù)和控制疾病進展的作用。用丹參酮 IIA 處理后發(fā)現(xiàn)了和 MI 免疫細胞相似的進展，值得注意的是，丹參酮 IIA 可以顯著減少第 3 天巨噬細胞/單核細胞數(shù)量，尤其是 M?-5 和 M?-6 的比例減少了 60%，炎癥相關(guān)的趨化因子（Ccl）、組織蛋白酶（Ctsd）和多功能細胞因子（Spp1）的表達水平也在丹參酮 IIA 處理后顯著降低。

腫瘤發(fā)生免疫逃避的其中一個原因是腫瘤抗原的丟失，使得免疫細胞失去對腫瘤的識別而不發(fā)生抗原呈遞。一種來自中草藥的小分子化合物白術(shù)內(nèi)酯 I（Atractylenolide I，ATT1）可以通過調(diào)節(jié) MHC-I 分子活性而起到調(diào)節(jié)人和小鼠結(jié)直腸癌抗原呈遞機制，增強 CD8+?T 細胞毒性的作用。2021 年 Xu 等利用單細胞測序技術(shù)揭示了 ATT1 治療可以增強 CD8+?T 細胞毒性，從而極大促進免疫檢查點阻斷治療的效果，為中醫(yī)藥“扶正治癌”提供了新證據(jù)。該研究利用盲腸壁植入 28 天的小鼠結(jié)直腸癌模型開展單細胞 CyTOF（質(zhì)譜流式）進行腫瘤免疫微環(huán)境分析，發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯 I（ATT1）可以增強 CD8+?T 細胞的浸潤和毒性，從而增強抗 PD-1 的抗腫瘤治療效果。只有 PD-1 mAb 和 ATTI 組合起來才能增加 T 細胞浸潤，同時減少巨噬細胞浸潤，從而形成抗腫瘤的免疫微環(huán)境。該研究進一步對小鼠結(jié)直腸癌模型樣本（ Control）和經(jīng) ATTI、PD1 mAb 及? ATTI + PD1 mAb 治療的小鼠結(jié)直腸癌樣本（Case）進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，解析了治療前后細胞類型和基因表達的變化，評估了不同治療條件下的治療效果，包括激活型 T 細胞和毒性 T 細胞相關(guān)基因的表達水平、效應(yīng) T 細胞的毒性分數(shù)及比例，證實了 ATT1 治療增強 CD8+?T 細胞毒性，從而極大促進免疫檢查點阻斷治療效果的作用。

復(fù)方黃黛片（ATI）在急性早幼粒白血?。ˋPL）的治療上應(yīng)有廣泛，但其多用于血液病治療，對于骨髓治療的反應(yīng)還未有研究。復(fù)方黃黛片的三個主要的單味藥是雄黃、青黛和丹參，三者的主要作用成分是三氧化二砷（As2O3，俗稱砒霜，A）、靛玉紅（T）和丹參酮IIA（I）。2022 年 Zhang 等利用單細胞測序來探究復(fù)方藥 ATI 的治療機制。該研究首先構(gòu)建了小鼠骨髓細胞圖譜，鑒定出 T 細胞、B 細胞、粒細胞、成紅細胞、MSC、成骨細胞（OLC）、軟骨細胞（ Chondrocytes）、成纖維細胞、骨髓內(nèi)皮細胞（BMECs）、周細胞、造血相關(guān)細胞和其他過渡態(tài)細胞。該研究進一步發(fā)現(xiàn)，ATI 在小鼠 APL 模型的治療中效果顯著，Lepr-MSCs、OLCs 和 BMECs 是 ATI 治療靶向最敏感的細胞類型。ATI 能夠調(diào)控骨髓中間充質(zhì)細胞的成骨分化、成脂分化、內(nèi)皮細胞遷移等相關(guān)基因的表達，改善正常造血相關(guān)基因表達，抑制白血病有關(guān)的 Lepr-MSCs、OLCs 和 BMECs 進展。ATI 具有維持骨髓基質(zhì)細胞穩(wěn)態(tài)和造血微環(huán)境穩(wěn)定的潛在機制，通過促進造血來輔助改善 APL 的治療效果。

02、中藥活性物質(zhì)合成及轉(zhuǎn)運機制的單細胞組學(xué)研究進展

中藥植物的研究思路是首先構(gòu)建中藥植物器官和組織發(fā)育和分化的細胞圖譜，然后揭示生物活性物質(zhì)合成所參與的細胞類型和基因表達模式，解析細胞發(fā)育軌跡及活性物質(zhì)的儲存及轉(zhuǎn)運機制。

荊芥產(chǎn)生的精油具有抗菌、消炎和抗病毒活性，是治流行感冒、頭疼寒熱發(fā)汗的良藥，在 SARS、COVID-19 和其他肺炎的治療中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。荊芥產(chǎn)生精油的關(guān)鍵是表皮的腺毛，2022 年 Zhou 等選取荊芥的嫩葉（n=3 ）提取原生質(zhì)體開展單細胞測序，來研究表皮腺毛的發(fā)育和分化機制。該研究一共獲得 33254 個細胞，聚類得到 19 個 Clusters，一共注釋為出 6 種細胞類型，包括表皮細胞（EC）/腺毛細胞、葉肉細胞（MC）、增殖細胞、維管細胞（VC）、伴胞細胞（CC）、保衛(wèi)細胞（GC）等。對表皮細胞/腺毛細胞群以及保衛(wèi)細胞? 進行進一步研究發(fā)現(xiàn)，其中的 E12 亞群特異高表達萜類上游 MEP 相關(guān)基因和薄荷烷類單萜生物合成相關(guān)的基因，E9 特異高表達萜類上游 MVA 相關(guān)基因。二者都富集“脂質(zhì)代謝過程”和“脂肪酸代謝過程”。因此得出結(jié)論，E12 很可能為特異性儲存和分泌生物活性精油（次生代謝物）的盾狀腺毛（peltate glandular trichomes，PGTs）細胞亞群，E9 則被推測為其他腺毛亞群。該研究進一步利用 Monocle2 對 E12、E9 和 E10 的細胞進行擬時序分析，結(jié)果顯示 E10 中的細胞向兩個方向—— E12（PGT）和 E9（其他毛狀體）分化，E10 為具有“細胞發(fā)育的調(diào)節(jié)”、“發(fā)育的細胞生長”和“參與分化的細胞形態(tài)發(fā)生的調(diào)節(jié)”等分化潛能的細胞群。

長春花能夠合成 130 多種單帖吲哚生物堿（MIA），其中包括抗癌藥物長春堿和長春新堿以及降壓藥物阿嗎堿和蛇根堿等，但是 MIA 生物合成所參與的細胞類型和基因表達模式仍未可知。2022 年 Sun 等選取長春花的嫩葉（n=3）提取原生質(zhì)體進行單細胞測序，來揭示 MIA 的生物合成和轉(zhuǎn)運機制。該研究將 65000 個原生質(zhì)體鑒定得到 7 種細胞類型，包括增殖細胞（Proliferating Cell，PC）、葉肉細胞（Mesophyll Cell，MC）、內(nèi)部韌皮部相關(guān)薄壁細胞（Internal Phloem-associated Parenchyma cell， IPAP）、異形細胞（Idioblast Cell，IC）、維管束細胞（Vascular Cell，VC）、表皮細胞（Epidermal Cell，EC）和氣孔細胞（Guard cell，GC）。為了研究不同細胞類型 MIA 途徑的功能活性，作者對 MIA 途徑相關(guān)基因的表達量進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲基赤蘚糖醇（MEP）途徑和環(huán)烯醚萜（Iridoid）途徑相關(guān)基因在 IPAP 中高度富集，說明 MIA 骨架中的萜類部分可能是主要通過 MEP 途徑在 IPAP 中合成的；而大多數(shù)甲羥戊酸（MVA）途徑的相關(guān)酶基因主要在 EC 中表達，說明 MIA 合成途徑的中間部分主要在 EC 中合成，包括從馬錢苷酸甲基轉(zhuǎn)移酶到長春質(zhì)堿合酶和水甘草堿合酶的 10 余個酶以及色氨酸脫氫酶。其他 MIA 分支途徑的酶基因多在 IC 中高表達，提示途徑的最后兩步在 IC 中完成。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在長春堿生物合成過程中，不同細胞類型之間的中間轉(zhuǎn)運至少發(fā)生了三次。有四種轉(zhuǎn)運體家族可能參與了植物生物堿的轉(zhuǎn)運：ABC（ATP-binding cassette transporter）、NPF（Nitrate/Peptide family）、MATE（Multidrug And Toxic Compound Extrusion Family,）和 PUP( Purine permease ?family）。通過細胞特異性表達分析發(fā)現(xiàn)，2 個 ABC、2 個 MATE 和 4 個 PUP 可能參與了 MIA 中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運，其中 CrMATE1、CrABCG8、CrNPF2.9 和 CrTPT2 等主要與 EC 轉(zhuǎn)運相關(guān)；多個 PUP 家族蛋白和 CrMATE16 等主要與 IC 轉(zhuǎn)運相關(guān)；而在這些候選轉(zhuǎn)運體中并沒有發(fā)現(xiàn) IPAP 特異性轉(zhuǎn)運體。最后，研究還揭示了內(nèi)皮細胞亞群的發(fā)育軌跡，不同亞群富集的基因及其功能不同，在 EC 特異表達的 MIA 基因的活性會受到 EC 發(fā)育的緊密調(diào)控。

總結(jié)來看，單細胞測序通過細胞異質(zhì)性分析、基因表達分析、細胞發(fā)育軌跡分析、細胞通訊分析等可以解析中醫(yī)藥對疾病的治療機制，發(fā)現(xiàn)對中醫(yī)藥治療最敏感的細胞以及治療所影響的關(guān)鍵基因的表達，從而揭示藥物作用的靶點或關(guān)鍵通路，揭示病理及治療機制。此外單細胞測序還可以構(gòu)建中藥植物器官和組織的細胞圖譜，解讀中藥植物的發(fā)育分化，并進一步揭示中藥活性物質(zhì)的合成及轉(zhuǎn)運機制。單細胞組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥方向的研究中已經(jīng)取得了可喜的進展，也一定是將來發(fā)展的重要趨勢。單細胞組學(xué)技術(shù)可以為打開中醫(yī)藥療效和原理研究的“黑匣子”帶來重大機遇！

參考文獻
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