隨著生物醫(yī)學的快速發(fā)展，越來越多的科學研究和臨床應用，對生物組織高分辨率三維成像提出了新的需求，比如腫瘤微環(huán)境、神經(jīng)投射、脈管系統(tǒng)等生命科學的研究，都需要生物組織完整的三維結構信息。由于生物組織不透明，傳統(tǒng)對生物組織三維成像的方法，依賴于組織切片的方式來完成，但是這種方式操作繁瑣，且成像通量低。因此，基于機械切片的技術方式越來越不能滿足當下的研究現(xiàn)狀，隨著組織透明化技術和光片顯微成像的結合，正式打開了三維結構可視化研究的大門。

案例分享

以往研究脊柱淋巴網(wǎng)絡的信息很少，因為這些精細的結構嵌入在椎體組織中，很難用傳統(tǒng)的組織學觀察。2019年發(fā)表在Nature communications一篇題為“Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice”的文章成功探究了小鼠脊柱淋巴網(wǎng)絡的結構與功能。在文章中，作者首先通過對脊柱節(jié)段采用iDISCO+方法進行免疫染色及透明化，結合一定的脫鈣處理，并利用光片熒光顯微鏡進行成像，發(fā)現(xiàn)脊柱椎管內(nèi)有廣泛而復雜的淋巴管系統(tǒng)。

原文Fig.2經(jīng)PROX1抗體染色的透明化胸椎，展示脊柱淋巴管系統(tǒng)的模塊化結構。

總之，組織透明化及3D成像技術可通過保留脊柱解剖結構和脈管系統(tǒng)三維連續(xù)性來描述淋巴、血管系統(tǒng)。

透明化染色方法流程：

文章使用了Renier及其同事開發(fā)的一種透明化方案，該方案基于甲醇脫水，并稱為對溶劑透明化的器官進行免疫標記的三維成像（iDISCO+， http://www.idisco.info ）。梯度增加的甲醇濃度會導致適度的組織收縮（約10%），以及組織的“透明度”增加：

1.經(jīng)過固定的樣品分別在20、40、60、80、100% 甲醇/PBS中逐步脫水1h。

2.然后將其在33%甲醇/66%二氯甲烷（DCM）的溶液中孵育過夜。

3.用100%甲醇洗滌2 × 1 h后，樣品用5% H2O2甲醇（1 vol 30% H2O2/5 vol甲醇）在4℃漂白過夜。

4.漂白后，樣品分別在80、60、40、20%甲醇、PBS中再水化1 h。

5.為了透明化脊柱，文章中添加了一個使用莫爾斯溶液的脫鈣步驟，在室溫下孵育30分鐘。使用莫爾斯溶液（1/1檸檬酸鈉和45%甲酸）的弱酸處理可以有效地對組織脫鈣，同時保留其結構。

6.用PBS快速洗滌樣品，然后在PTx2 （PBS/0.2% Triton X-100）中孵育2 × 1 h。在這一步后，對樣本進行免疫染色處理。

7.樣本在PBS/0.2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M甘氨酸中，37℃孵育24 h。

8.然后在PBS/0.2% Triton X-100/10% DMSO/6%驢血清中，37℃封閉24 h。

9.樣品在PTwH （PBS/0.2%吐溫-20與10 mg/ml肝素）/5% DMSO/3%驢血清的一抗稀釋液中，37℃孵育6天。

10.樣本在PTwH中洗滌5次直至次日。

11.然后在PTwH/3%驢血清二抗體稀釋中，37℃孵育4天。

12.最后在PTwH中洗滌5次直至次日。

13.然后將樣本在33%/DCM 66%甲醇溶液中孵育過夜。

14.隨后在100% DCM中孵育2 × 15 min以洗滌甲醇。

15.最后，樣品在二芐醚（DBE）中孵育，直到透明化（約4 h），即可成像。

Reference：

Jacob L, Boisserand LSB, Geraldo LHM, et al. Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice. Nat Commun. 2019;10(1):4594.

Renier N, et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 2014;159:896–910.

Morse A. Formic acid-sodium citrate decalcification and butyl alcohol dehydration of teeth and bones for sectioning in paraffin. J. Dent. Res. 1945;24:143–153.

Shibata Y, Fujita S, Takahashi H, Yamaguchi A, Koji T. Assessment of decalcifying protocols for detection of specific RNA by non-radioactive in situ hybridization in calcified tissues. Histochem. Cell Biol. 2000;113:153–159.

González-Chávez SA, Pacheco-Tena C, Macías-Vázquez CE, Luévano-Flores E. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2013;6:1972–1983.

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