NK細(xì)胞無(wú)需抗原預(yù)先致敏，即可快速反應(yīng)并同時(shí)激活免疫系統(tǒng)來(lái)協(xié)同發(fā)揮殺傷作用，堪稱(chēng)免疫細(xì)胞里的航空母艦?？茖W(xué)家對(duì)NK細(xì)胞療法也寄予厚望，全球的NK細(xì)胞相關(guān)療法也在如火如荼的進(jìn)行著。如何高效利用NK細(xì)胞幫助我們戰(zhàn)勝疾病，科學(xué)家們?yōu)榇艘恢痹谂χ?，今天我們就?lái)系統(tǒng)的了解一下如何在各個(gè)環(huán)節(jié)提高NK細(xì)胞的純度，以達(dá)到最好的治療效果。

首先我們需要了解NK細(xì)胞是一種自然免疫細(xì)胞，廣泛存在于人體的外周血、骨髓、脾、淋巴結(jié)等組織中。在細(xì)胞來(lái)源方面，外周血中的NK細(xì)胞含量較高，是常用的來(lái)源之一【1】，另外臍帶血產(chǎn)業(yè)在近幾年迅速發(fā)展，也成為NK細(xì)胞主要來(lái)源之一。除此之外，也可以從人體骨髓、脾、淋巴結(jié)等組織中獲得NK細(xì)胞，但這些來(lái)源的細(xì)胞數(shù)較少，需要經(jīng)過(guò)特殊處理才能得到足夠的細(xì)胞量。

01血樣采集和處理

首先，需要從健康人體中采集血樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了避免血液的凝固和失活，建議在血樣采集后盡快進(jìn)行處理。外周血采集建議首選肝素鈉采血管，最好在采血后4小時(shí)內(nèi)安排分離實(shí)驗(yàn)。而采集臍血無(wú)法選用采血管，必須用采血袋，建議使用抗凝劑較少的采血袋（比如100ml的袋子內(nèi)含14ml抗凝保存液），以更大程度防止血鈣流失。血液處理可以使用Ficoll梯度離心分離法（以外周血為例），具體方法如下：

1、將采集的外周血室溫下進(jìn)行離心處理（操作前請(qǐng)進(jìn)行檢菌），離心15分鐘，離心速度設(shè)置為750g左右。此時(shí)，血液將被分為兩個(gè)層次：上層為血漿，下層為白細(xì)胞、紅細(xì)胞和粘稠物。

2、自體血漿分離

2.1 操作1離心結(jié)束后用移液管將上層血漿轉(zhuǎn)入離心管進(jìn)行密封滅活（血漿放入水浴鍋56℃滅活半小時(shí)），滅活后的血漿置于4℃冰箱半小時(shí)，防止補(bǔ)體、血小板等對(duì)細(xì)胞活化產(chǎn)生影響；

2.2 取出冰箱血漿進(jìn)行再次離心，離心10分鐘，離心速度1000g左右，取上清作為自體血漿置于4℃冰箱備實(shí)驗(yàn)需用。

3、單個(gè)核細(xì)胞PBMC分離

3.1 操作1離心結(jié)束后獲得的血細(xì)胞沉淀用等體積生理鹽水重懸混勻，然后將混勻的血細(xì)胞緩慢加入到離心管中Ficoll層上（確保分層清晰）；

3.2?將離心管放入離心機(jī)進(jìn)行離心處理，離心25分鐘，離心速度930g左右，離心結(jié)束后棄去上清并吸取白膜層細(xì)胞（盡量吸盡液面交界處的細(xì)胞層）

3.3 吸取到的白膜層細(xì)胞放入新的離心管，用生理鹽水重懸混勻定容至100mL并進(jìn)行離心處理，離心8分鐘，離心速度750g；

3.4 可再次洗滌細(xì)胞。棄上清，重懸細(xì)胞，吸取少量細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度后種瓶。

02刺激激活

為了提高NK細(xì)胞的殺傷活性，需要在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加一些刺激劑，如IL-2、IL-15等。IL-2和IL-15的加入可以促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和分化，同時(shí)提高細(xì)胞的殺傷活性。在激活NK細(xì)胞時(shí)，我們將其培養(yǎng)在含有IL-2和IL-15的培養(yǎng)基中，以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和活化。不過(guò)值得注意的是，從PBMCs誘導(dǎo)培養(yǎng)也會(huì)刺激CD3+?T和NKT（CD3+CD56+）細(xì)胞的擴(kuò)增。因此，基于異體移植可能引起的T細(xì)胞介導(dǎo)的同種異體反應(yīng)性，可以考慮提前通過(guò)磁分選消除其他免疫細(xì)胞，以便培養(yǎng)可以獲得高純度的NK細(xì)胞，這也是CAR-NK細(xì)胞制備獲得高純度細(xì)胞的關(guān)鍵。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：

1、完全培養(yǎng)基配置：1L培養(yǎng)基加入IL-2，終濃度為 1000IU/mL。

2、細(xì)胞計(jì)數(shù)：用少量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞（PBMCs），吸取少量細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度1.5-2×106?個(gè)/mL。

3、種瓶：將細(xì)胞懸液中加入激活因子和滅活血漿，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)終體積約 25mL(為了更有效刺激NK細(xì)胞激活，可提前采用包被液包被培養(yǎng)瓶)。

4、將培養(yǎng)瓶放入37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)期間每隔一天補(bǔ)充一次培養(yǎng)基。

5、培養(yǎng)7天后，我們將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋繼續(xù)培養(yǎng)。

當(dāng)NK細(xì)胞被激活時(shí)，檢測(cè)的維度是多樣的，可以檢測(cè)活性、殺傷毒性等等，常見(jiàn)的方法有以下三種：

1.流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry）：流式細(xì)胞術(shù)是一種常用的檢測(cè)方法，可以通過(guò)檢測(cè)表面標(biāo)記物和內(nèi)部蛋白來(lái)確定細(xì)胞類(lèi)型和功能。通過(guò)使用特定的抗體，可以檢測(cè)到激活的NK細(xì)胞表面上的活化標(biāo)記物，如CD16、CD56、和CD137等。

2.細(xì)胞活性測(cè)定（Cellular cytotoxicity assay）：細(xì)胞活性測(cè)定可以評(píng)估NK細(xì)胞的殺傷能力。在這種測(cè)試中，將被測(cè)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，然后測(cè)量腫瘤細(xì)胞的死亡率。如果激活的NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，那么腫瘤細(xì)胞死亡率將會(huì)升高【2】。

3．酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）：ELISA可以檢測(cè)細(xì)胞因子和其他蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。在NK細(xì)胞激活的情況下，細(xì)胞因子如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等會(huì)被分泌出來(lái)。通過(guò)檢測(cè)這些分泌的細(xì)胞因子水平，可以評(píng)估NK細(xì)胞的激活狀態(tài)。

03擴(kuò)增階段

在完成刺激激活之后，NK細(xì)胞需要進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，以增加其數(shù)量和活性，以便進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用。在培養(yǎng)NK細(xì)胞時(shí)，我們需要選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。最常用的培養(yǎng)基是無(wú)血清免疫細(xì)胞培養(yǎng)基，其中包含必需氨基酸、維生素和微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。此外，還可以添加一些生長(zhǎng)因子，如白細(xì)胞介素-2（IL-2），以促進(jìn)NK細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)增。在一些研究中，還會(huì)添加一些其他的細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-12（IL-12）、白細(xì)胞介素-15（IL-15）、白細(xì)胞介素-18（IL-18）、白細(xì)胞介素-21（IL-21）等，以提高NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和殺傷作用。

其中IL-2在短時(shí)間內(nèi)可促進(jìn)NK細(xì)胞的存活、并激活提高細(xì)胞毒性。主要由于IL-2刺激PBMCs可導(dǎo)致淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞LAK數(shù)量增加（LAK前體細(xì)胞是由NK細(xì)胞和T細(xì)胞組成），因此對(duì)自體腫瘤細(xì)胞具有較高的殺傷能力；其次IL-2和IL-15聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和活性，更有利于NK細(xì)胞的激活，特別的是IL-2和IL-15聯(lián)用可誘導(dǎo)NK細(xì)胞活化受體NKG2D、NKp44、NKp30和NKp46的表達(dá)，提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒性；研究表明IL-12也可用于體外NK細(xì)胞培養(yǎng)，刺激NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ；另外IL-12、IL-15和IL-18聯(lián)合可以誘導(dǎo)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的記憶樣NK細(xì)胞（CIML），CIML是一種壽命長(zhǎng)、細(xì)胞毒性高、分泌IFN-γ的細(xì)胞。CIML-NK細(xì)胞已在小鼠腫瘤模型中進(jìn)行過(guò)繼免疫治療，并顯示出抗黑色素瘤和淋巴瘤的良好效果；白細(xì)胞介素-21是一種四螺旋束的細(xì)胞因子，對(duì)淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞具有多種生物學(xué)效應(yīng)，能誘導(dǎo)NK細(xì)胞的成熟，并增強(qiáng)其細(xì)胞毒性，并且IL-21與IL-2或IL-15組合能誘導(dǎo)NK細(xì)胞的增殖，對(duì)NK 細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。

在擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)程中，我們還需要注意一些關(guān)鍵的指標(biāo)，如細(xì)胞密度、細(xì)胞存活率和細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況等。通常，NK細(xì)胞的最佳擴(kuò)增密度為1-2×106/mL。為了保證細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，我們需要每2-3天補(bǔ)充新的培養(yǎng)基，并添加適量的生長(zhǎng)因子和自體血漿。除了培養(yǎng)基、生長(zhǎng)因子和自體血漿之外，還需要注意細(xì)胞培養(yǎng)的溫度、濕度和二氧化碳濃度等條件。NK細(xì)胞的最佳培養(yǎng)條件為37℃、5% 二氧化碳。在擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)程中，我們還需要檢測(cè)細(xì)胞的活性和表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，以確保細(xì)胞的質(zhì)量和適用性。最常用的檢測(cè)方法是流式細(xì)胞術(shù)，通過(guò)特定的熒光標(biāo)記物和抗體，可以對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)和分析。

結(jié)語(yǔ)：科學(xué)家們?yōu)榱嗽隰~(yú)龍混雜的體系之中提純出NK細(xì)胞進(jìn)行了數(shù)十年的研究，我們從上文的方法可以看出各種方法都存在自己的優(yōu)越性以及局限性，這就需要我們學(xué)會(huì)理性分析自己的需求特點(diǎn)，選擇合適的提純方案，并在實(shí)踐中不斷優(yōu)化和改進(jìn)技術(shù)。我國(guó)的NK細(xì)胞療法起步雖然略慢，但是我們充分利用了產(chǎn)業(yè)模式以及廣納最新的科學(xué)技術(shù)，發(fā)展出許多NK細(xì)胞提純的平臺(tái)，為我國(guó)NK細(xì)胞相關(guān)研究和應(yīng)用保駕護(hù)航。在疫情陰霾完全散去的今天，我國(guó)的免疫治療領(lǐng)域正如NK細(xì)胞本身一樣，在監(jiān)管反應(yīng)和協(xié)同方面同時(shí)發(fā)力，為戰(zhàn)勝疾病貢獻(xiàn)自己的力量。

Hi，大家好！

同立海源生物研發(fā)生產(chǎn)的GMP級(jí)IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21均可滿足NK/CAR-NK細(xì)胞藥物開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證、申報(bào)等不同階段的需求。

01規(guī)范的GMP生產(chǎn)環(huán)境和管理體系

? ?公司生產(chǎn)車(chē)間是萬(wàn)級(jí)C+A潔凈車(chē)間，制劑車(chē)間按照B級(jí)無(wú)菌制劑要求灌裝，制劑采用藥用輔料；

? ?公司執(zhí)行ISO13485、ISO9001質(zhì)量管理體系，保障物料及過(guò)程的可控性與可追溯性。

02生產(chǎn)和質(zhì)量控制遵循相關(guān)法規(guī)

《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）》

《GMP 附錄-細(xì)胞治療產(chǎn)品》（征求意見(jiàn)稿）

《中國(guó)藥典》

03質(zhì)量保證

???采用無(wú)動(dòng)物源性材料生產(chǎn)和藥用輔料制劑

?? 無(wú)菌、無(wú)氨芐抗生素、無(wú)HBV、HCV、HIV等病原體、無(wú)支原體

? 內(nèi)毒素低于10EU/mg、宿主蛋白殘留低于0.005%、外源性DNA殘留低于100pg/mg

???活性高、純度高、穩(wěn)定性高

?? 批間一致性好

???藥用西林瓶包裝

產(chǎn)品信息 >>

參考文獻(xiàn)：

【1】Rossi F, Fredericks N, Snowden? A,? Allegrezza? MJ, Moreno-Nieves? UY.? Next Generation Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Front? ?Immunol. 2022 Jun 2;13:886429.

【2】 Kim J, Phan MT, Kweon S, Yu H, Park J, Kim KH, Hwang I, Han S, Kwon MJ, Cho D. A Flow Cytometry-Based Whole Blood Natural Killer Cell Cytotoxicity Assay Using Overnight Cytokine Activation. Front Immunol. 2020 Aug 14;11:1851.

【3】 Kim TJ, Kim M, Kim HM, Lim SA, Kim EO, Kim K, Song KH, Kim J, Kumar V, Yee C, Doh J, Lee KM. Homotypic NK cell-to-cell communication controls cytokine responsiveness of innate immune NK cells. Sci Rep. 2014 Dec 5;4:7157.

關(guān)于同立海源

北京同立海源生物科技有限公司，成立于2011年，專(zhuān)注細(xì)胞和基因治療（CGT）上游GMP級(jí)原料試劑研發(fā)，致力于為生命科學(xué)提供可靠的產(chǎn)品與服務(wù)。產(chǎn)品涉及細(xì)胞分選磁珠試劑，真核/原核重組蛋白、無(wú)血清培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑、基因編輯工具酶等。為細(xì)胞和基因治療藥物、抗體藥物開(kāi)發(fā)、細(xì)胞儲(chǔ)存等生物制藥和IVD領(lǐng)域提供核心原料試劑與服務(wù)。

公司建有2000㎡的研發(fā)實(shí)驗(yàn)室及GMP級(jí)潔凈車(chē)間，包括真核與原核蛋白表達(dá)工程平臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)開(kāi)發(fā)平臺(tái)、體外診斷試劑生產(chǎn)平臺(tái)，通過(guò)ISO13485和ISO9001雙認(rèn)證，部分產(chǎn)品已獲美國(guó)FDA DMF備案。