四川大學華西醫(yī)院骨科運動醫(yī)學中心付維力副教授與清華大學張學工教授團隊合作在國際著名生物學綜合期刊?eLife?發(fā)表題為“Cellular features of localized microenvironments in human meniscal degeneration: a single-cell transcriptomic study”的研究論文，利用單細胞測序結(jié)合多重免疫熒光的方法，構(gòu)建了健康狀態(tài)以及退變狀態(tài)下半月板紅、白區(qū)細胞圖譜，為研究半月板內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及探索骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生機制提供重要依據(jù)。該研究中的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)由博奧晶典提供。

【發(fā)表期刊】eLife

【影響因子】8.713

【發(fā)表單位】四川大學華西醫(yī)院，清華大學

研究背景

半月板是膝關(guān)節(jié)的重要組成部分，在膝關(guān)節(jié)軟骨的承重、減震、營養(yǎng)和潤滑等方面發(fā)揮著重要作用，但其非常容易受傷，修復潛力有限。半月板退變是骨關(guān)節(jié)炎（OA）和關(guān)節(jié)功能障礙的重要危險因素之一，充分了解退行性半月板的變化對于預防中青年患者半月板損傷和緩解老年膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者的癥狀至關(guān)重要。

研究思路

研究結(jié)果

1、利用單細胞 RNA 測序解析人類半月板的主要細胞類型

文章首先展示了作者從 8 名患者的共計 12 個（6 個正常vs 6 個退行性）半月板樣本中得到 45,744 個單細胞數(shù)據(jù)，來解析人類半月板的細胞異質(zhì)性。在半月板內(nèi)側(cè)白區(qū)中鑒定得到 5 種主要的細胞類型：軟骨細胞、淋巴細胞、髓樣細胞、內(nèi)皮細胞和?ACTA2+細胞（圖1D）。在半月板外側(cè)紅區(qū)中鑒定得到 6 種細胞類型，除軟骨細胞、淋巴細胞、髓樣細胞、內(nèi)皮細胞及?ACTA2+?細胞外，還有 Schwann 細胞（圖1G），表明半月板紅區(qū)中存在神經(jīng)組織。此外，在半月板紅區(qū)細胞中，與正常組相比，退化組的免疫細胞比例較高，而?ACTA2+?細胞比例較低（圖1H）。

2、進一步聚類揭示軟骨細胞與周細胞（PCL）的異質(zhì)性

接下來文章通過單細胞測序結(jié)果，進一步對軟骨細胞及 PCL 細胞聚類，建立分級式細胞類型分類框架（圖2）。最終軟骨細胞鑒定得到 5 種細胞亞型，分別為 Ch.1-Ch.5，PCL 細胞聚類得到 PCL.1、PCL.2 兩種細胞亞型。每個亞型都具有特定的基因調(diào)控模塊（圖2D），例如，軟骨細胞亞型 Ch.1 具有抗血管生成的功能，Ch.3 亞型中高水平表達的?PRG4?基因與關(guān)節(jié)軟骨表面潤滑功能相關(guān)，可能具有潤滑功能。表明了軟骨細胞及 PCL 細胞內(nèi)部的異質(zhì)性。

3、通過差異基因表達與富集分析揭示軟骨細胞及 PCL 細胞相關(guān)功能變化

與正常組相比，Ch.1、PCL 細胞占比下降，Ch.2、Ch.3、Ch.4 亞型占比增加（圖3B）。其中，Ch.2 亞型中 OA 標記基因和軟骨細胞肥大基因高表達（如膠原基因（COL1A1/2，COL3A1，COL6A1/2/3），POSTN，MMP2，SPARC，MXRA5等），表明 Ch.2 與異常細胞外基質(zhì)（ECM）退化和重塑相關(guān)（圖3A）。Ch.4中補體替代激活途徑（C1R，C1S，C2，C3，C6?和?C7）相關(guān)基因高度表達，可能通過富集巨噬細胞和中性粒細胞來促進炎癥（圖3）。在 PCL 細胞中發(fā)現(xiàn)有多種潛在的血管生成抑制基因的表達，促血管生成基因表達較低。PCL.1 和 PCL.2 中均發(fā)現(xiàn)了與抗血管生成功能相關(guān)的?COL4A1、COL4A2?和?COL18A1?等基因表達。PCL.1 對促炎細胞因子 IL-1 和 TNF-α 有更積極的反應（圖2G），PCL.2 具有較高的肌原纖維基因表達，肌肉收縮力較高，可調(diào)節(jié)微血管中的血液流動。此外，退變組半月板外側(cè)的炎癥評分始終顯著高于正常組，推斷半月板外側(cè)區(qū)域的退變可能對關(guān)節(jié)炎癥影響更大。

4、利用細胞間通訊分析解析半月板退變機制

在正常和退化半月板樣本中對白細胞進一步聚類，鑒定得到巨噬細胞/單核細胞、中性粒細胞、肥大細胞、樹突狀細胞、T 細胞和循環(huán)免疫細胞（圖4A，B）。根據(jù)配體-受體的表達推斷細胞-細胞相互作用（CCIs），與正常組相比，退變組 CCI 強度普遍升高，尤其是內(nèi)皮細胞和免疫細胞（圖4I）。CXCL8?基因在退變組的巨噬細胞/單核細胞、中性粒細胞、DC 中上調(diào)，其受體基因?SDC2?在軟骨細胞和 PCL 細胞中均有表達。退變組血管新生進程中也出現(xiàn)了顯著的?CALM1/2-INSR?CCIs，多數(shù)細胞類型中?CALM1/2?上調(diào)，內(nèi)皮細胞中胰島素受體基因?INSR?上調(diào)，表明胰島素受體具有促血管生成功能。

結(jié)論

免疫細胞和內(nèi)皮細胞可能是軟骨細胞和細胞外基質(zhì)的重要調(diào)節(jié)因子（圖5）。免疫細胞可以感知 DAMP 信號，在半月板炎癥進程中產(chǎn)生細胞因子和趨化因子。同時，炎癥可以增強 ECM 分解代謝酶，如?MMP/ADAM/ADAMTS，刺激血管增殖，進一步促進半月板中的免疫浸潤效果。這些因素以一種類似“正反饋循環(huán)”的方式起作用。正常情況下，當 DAMP 分子被清除時，可逆轉(zhuǎn)由 DAMP 引起的炎癥。但如果上述因素在某些擾動條件下處于“正反饋”通路中，它們將相互促進影響半月板微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。