基于UPLC-Triple-TOF/MS分析續(xù)斷“發(fā)汗”前后化學(xué)成分

摘 要：目的 通過超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC-Triple-TOF-MS）快速分析續(xù)斷Dipsaci?Radix“發(fā)汗”前后的化學(xué)成分。方法 采用AgilentEclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色譜柱；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫，體積流量為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，柱溫為25 ℃；質(zhì)譜采用UPLC-Triple-TOF 5600+飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用儀，負(fù)離子模式下掃描檢測(cè)，掃描范圍m/z?100～1 500。根據(jù)高分辨質(zhì)譜結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜所得的信息對(duì)續(xù)斷“發(fā)汗”前后化學(xué)成分進(jìn)行快速的鑒定。結(jié)果 根據(jù)化合物保留時(shí)間、質(zhì)譜信息，推測(cè)了續(xù)斷“發(fā)汗”前后52個(gè)共有化學(xué)成分，主要包括三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜類、酚酸類等，同時(shí)分析了主要成分的裂解規(guī)律。并比較了續(xù)斷“發(fā)汗”前后化學(xué)成分的差異，發(fā)現(xiàn)發(fā)汗后馬錢苷酸、綠原酸、馬錢苷、異綠原酸A、川續(xù)斷皂苷VI等20種成分含量降低，咖啡酸、異綠原酸、異綠原酸C、大花雙參苷A等成分含量在發(fā)汗后升高。結(jié)論 研究發(fā)現(xiàn)續(xù)斷“發(fā)汗”前后化學(xué)成分種類上無明顯差異，而在成分含量上存在一定差異，未“發(fā)汗”續(xù)斷化學(xué)成分含量普遍高于“發(fā)汗”續(xù)斷。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Triple-TOF-MS技術(shù)分析“發(fā)汗”對(duì)續(xù)斷的化學(xué)成分的影響，為探究續(xù)斷“發(fā)汗”前后化學(xué)成分物質(zhì)基礎(chǔ)和進(jìn)一步為續(xù)斷產(chǎn)地加工方式的研究提供理論依據(jù)。

續(xù)斷又名接骨草、龍豆、和尚頭、鼓錘草，為川續(xù)斷科川續(xù)斷屬植物川續(xù)斷Dipsacus?asper?Wall. ex Henry的根[1]，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、續(xù)折傷、止崩漏的作用，道地產(chǎn)區(qū)主要分布在四川省攀枝花及西昌一帶?，F(xiàn)代藥理研究表明，續(xù)斷具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗凝血、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用[2-4]。續(xù)斷始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，其傳統(tǒng)產(chǎn)地初加工方法為去蘆頭、根頭及須根，用微火烘至半干，堆置“發(fā)汗”至內(nèi)部變綠色時(shí)，再烘干?！吨袊?guó)藥典》2015年版規(guī)定，續(xù)斷采用“發(fā)汗”的產(chǎn)地加工方 法[1]。近年來，市場(chǎng)上存在使用沒有發(fā)汗或未發(fā)汗完全的續(xù)斷藥材，并且其顏色和性狀與發(fā)汗完全的續(xù)斷藥材存在很大的區(qū)別[5]。目前“發(fā)汗”機(jī)制尚不明確[6]，續(xù)斷“發(fā)汗”的研究較少，且主要集中在“發(fā)汗”對(duì)續(xù)斷某一類成分的影響[7-11]。因此，全面研究“發(fā)汗”對(duì)續(xù)斷化學(xué)成分的影響具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Triple-TOF-MS技術(shù)分析“發(fā)汗”前后續(xù)斷的化學(xué)成分，探究了產(chǎn)地加工“發(fā)汗”對(duì)續(xù)斷化學(xué)成分的影響，為探究續(xù)斷“發(fā)汗”前后化學(xué)成分物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)，并為全面評(píng)價(jià)續(xù)斷發(fā)汗前后的藥材質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1?儀器與試藥

1.1?儀器

UPLC-Triple-TOF/MS系統(tǒng)：AcquityTM ultra型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Triple TOF 5600+型飛行時(shí)間質(zhì)譜，配有電噴霧離子源，美國(guó)AB SCIEX公司；Eppendorf Minispan離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。

1.2?試藥

續(xù)斷藥材購(gòu)自四川西昌（批號(hào)180709），經(jīng)由浙江中醫(yī)藥大學(xué)來平凡教授鑒定為川續(xù)斷科川續(xù)斷屬植物川續(xù)斷Dipsacus?asper?Wall. ex Henry的干燥根；未“發(fā)汗”樣品為續(xù)斷采新后直接曬干而成，發(fā)汗樣品為續(xù)斷采收后除去根頭和須根，用微火烘至半干，堆置“發(fā)汗”至內(nèi)部變綠色時(shí)，再烘干[1]，發(fā)汗和未發(fā)汗樣品均由同一批續(xù)斷藥材制得。乙腈和甲酸為色譜純，Merck公司；水為Milli-Q超純水，其余試劑為分析純。

2?方法

2.1?供試品溶液制備

分別取過80目篩的續(xù)斷“發(fā)汗”品和未“發(fā)汗”品粉末各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2?液相條件

UPLC-Triple-TOF 5600+飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用儀；色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，線性梯度洗脫：0～45 min，6%～20%乙腈；45～90 min，20%～35%乙腈；90～110 min，35%～70%乙腈；110～120 min，70%乙腈；柱溫為25 ℃，體積流量為0.8mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.3?質(zhì)譜條件

UPLC-Triple-TOF 5600+飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用儀：負(fù)離子掃描模式；掃描范圍m/z?100～1 500；霧化氣（GS1）：344.738 kPa（50 psi）；霧化氣（GS2）344.738 kPa（50 psi）；氣簾氣（CUR）：241.317 kPa（35 psi）；離子源溫度（TEM）550 ℃；離子源電壓（IS）?4 500 V；一級(jí)掃描：去簇電壓（DP）100 V；聚焦電壓（CE）10 V；二級(jí)掃描：使用TOF MS～Product Ion～I(xiàn)DA模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)；CID能量20、40、60 V；進(jìn)樣前，用CDS泵做質(zhì)量軸校正，使質(zhì)量軸誤差小于2×10?6。

3?結(jié)果與分析

3.1?續(xù)斷“發(fā)汗”前后化合物結(jié)果分析

續(xù)斷“發(fā)汗”前后供試品溶液在“2.2”和“2.3”項(xiàng)色譜及質(zhì)譜條件下，分析出續(xù)斷“發(fā)汗”前后樣品UPLC-Triple-TOF/MS的總離子流圖，見圖1。課題組前期研究通過對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)了其中8個(gè)成分（馬錢苷酸、綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、川續(xù)斷皂苷VI[12]）。根據(jù)液質(zhì)碎片離子峰信息，并比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)，共得到52種化學(xué)成分，結(jié)果見表1。

3.2?化合物結(jié)構(gòu)分析

通過查閱國(guó)內(nèi)外續(xù)斷及其同科屬化學(xué)成分研究的相關(guān)文獻(xiàn)，并借助Scifinder和Reaxys數(shù)據(jù)庫(kù)，收集整理了續(xù)斷中各類化學(xué)成分。利用液質(zhì)聯(lián)用儀采集數(shù)據(jù)后，提取各色譜峰的質(zhì)譜圖，根據(jù)準(zhǔn)分子離子[M－H]?和加荷離子 [M＋HCOO]?信息判斷得到的一級(jí)質(zhì)譜精確相對(duì)分子質(zhì)量，通過Peakview 1.2軟件在5×10?6的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)擬合分子式，比對(duì)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，完成各色譜峰初步推測(cè)。從二級(jí)質(zhì)譜中獲得化合物相應(yīng)的碎片離子及其信息，結(jié)合碎片離子的裂解情況和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)一步推測(cè)化學(xué)成分。

3.2.1?酚酸類 化合物4（tR＝20.41 min）在負(fù)離子模式下m/z?353.088 1 [M－H]?，質(zhì)譜軟件計(jì)算出精確分子式為C16H18O9，觀察二級(jí)質(zhì)譜離子碎片，化合物主要碎片離子為m/z?191.055 5 [M－H－caffeoyl]?，與課題組前期對(duì)照品比對(duì)研究[12]及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[15]比對(duì)，鑒定該化合物為綠原酸。

化合物14、15、17?TOF/MS均給出分子離子峰m/z515.119 5，質(zhì)譜軟件計(jì)算出精確分子式為C25H24O12，與文獻(xiàn)報(bào)道的異綠原酸類分子式一致，再根據(jù)其主要二級(jí)碎片離子裂解規(guī)律，與課題組前期對(duì)照品比對(duì)研究[12]及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[14]比對(duì)，鑒定化合物14、15、17分別為異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C。本實(shí)驗(yàn)列舉異綠原酸B裂解途徑見圖2。

3.2.2?環(huán)烯醚萜苷類 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[14,16]續(xù)斷提取物中含有獐牙菜苷、林生續(xù)斷苷I、茶茱萸苷等類成分，根據(jù)化合物7、12、16二級(jí)質(zhì)譜離子碎片分析，推測(cè)結(jié)構(gòu)中均存在葡萄糖結(jié)構(gòu)，根據(jù)Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推測(cè)化合物峰7、12、16分別為獐牙菜苷、林生續(xù)斷苷I、茶茱萸苷。

化合物6（tR＝26.42 min）在負(fù)離子模式下m/z435.151 3 [M＋HCOO]?，質(zhì)譜軟件計(jì)算出精確分子式為C17H26O10，觀察二級(jí)質(zhì)譜離子碎片，化合物主要碎片離子為m/z?227.092 3、127.039 9、101.025 3，課題組前期對(duì)照品比對(duì)研究[12]及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[14]比對(duì)，鑒定該化合物為馬錢苷，推測(cè)其裂解途徑見圖3。

3.2.3?皂苷類 續(xù)斷皂苷類成分均屬于五環(huán)三萜類齊墩果烷型衍生物，苷元多數(shù)為常春藤皂苷元，少數(shù)為齊墩果酸皂苷元[18]，皂苷中含有葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖等糖鏈結(jié)構(gòu)，在裂解過程中呈現(xiàn)出易脫去糖鏈的規(guī)律。

化合物23、24在一級(jí)質(zhì)譜中 [M－H]?豐度較高，質(zhì)譜軟件計(jì)算出精確分子式為C59H96O26，觀察二級(jí)質(zhì)譜離子碎片，均存在m/z471.347 8，可能為常春藤皂苷元，結(jié)合其他碎片離子峰，推測(cè)結(jié)構(gòu)中存在葡萄糖和鼠李糖結(jié)構(gòu)。根據(jù)Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，推測(cè)化合物23、24分別為川續(xù)斷皂苷B和川續(xù)斷皂苷VII，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]。

化合物26（tR＝78.86 min）在負(fù)離子模式下m/z1 073.553 9 [M－H]?，質(zhì)譜軟件計(jì)算出精確分子式為C53H86O22，觀察二級(jí)質(zhì)譜離子碎片，化合物主要碎片離子為m/z1 073.564 6、749.453 3、323.0970，通過Scifinder及Reaxys數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，鑒定該化合物為川續(xù)斷皂苷乙，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，推測(cè)其裂解途徑見圖4。

化合物28（tR＝80.72 min）在負(fù)離子模式下m/z973.501 2 [M＋HCOO]?，質(zhì)譜軟件計(jì)算出精確分子式為C47H76O18，觀察二級(jí)質(zhì)譜離子碎片，化合物主要碎片離子為m/z?927.505 1、603.392 7、323.098 8、179.056 1，通過Scifinder及Reaxys數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，并結(jié)合課題組前期對(duì)照品比對(duì)研究[12]及文獻(xiàn)報(bào)道[15,19]比對(duì)，鑒定該化合物為川續(xù)斷皂苷VI，推測(cè)其裂解途徑見圖5。

根據(jù)TOF/MS結(jié)果，化合物32、34、35均與化合物28差1個(gè)乙酰基，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜離子碎片分析，推測(cè)結(jié)構(gòu)中存在2個(gè)葡萄糖結(jié)構(gòu)，根據(jù)Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，鑒定化合物32、34、35為4′-O-乙?；ɡm(xù)斷皂苷Ⅵ，2′-O-乙?；ɡm(xù)斷皂苷VI、3′-O-乙?；ɡm(xù)斷皂苷VI，質(zhì)譜行為與文獻(xiàn)報(bào)道[15,19]一致。

3.3?續(xù)斷“發(fā)汗”前后化學(xué)成分比較

觀察圖1可以推測(cè)出續(xù)斷“發(fā)汗”前后，在化學(xué)成分含量上存在一定差異，馬錢苷酸、綠原酸、馬錢苷、異綠原酸A、川續(xù)斷皂苷VI、7-脫氧馬錢苷酸、茶茱萸苷、川續(xù)斷皂苷VII、mazusaponin I、川續(xù)斷皂苷乙、medicoside F、4′-O-乙?；ɡm(xù)斷皂苷VI、川續(xù)斷皂苷VI 4-氨基-2-丁烯酸衍生物、2′-O-乙酰基川續(xù)斷皂苷VI、3′-O-乙酰基川續(xù)斷皂苷VI、HN-saponin F、dipsacussaponin A、川續(xù)斷皂苷V、asperosaponin B異構(gòu)體、asperosaponin B等在發(fā)汗后含量顯著降低，咖啡酸、異綠原酸、異綠原酸C、大花雙參苷A等成分含量在發(fā)汗后上升，但尚未發(fā)現(xiàn)新增或消失的成分。也許正是這些變化的成分在影響著續(xù)斷發(fā)汗前后的質(zhì)量差異。

4?討論

為獲得更好的色譜分離和質(zhì)譜效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)考察了不同梯度的洗脫條件，考慮到對(duì)色譜柱及儀器的保護(hù)，根據(jù)三萜皂苷、環(huán)烯醚萜苷等化合物的化學(xué)性質(zhì)，選擇以0.1%甲酸水溶液-乙腈，線性梯度洗脫。質(zhì)譜條件中比較了正、負(fù)離子檢測(cè)模式，發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式質(zhì)譜響應(yīng)明顯優(yōu)于負(fù)離子模式，同時(shí)結(jié)合三萜皂苷、環(huán)烯醚萜苷等化合物結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異，因此本實(shí)驗(yàn)在負(fù)離子下定性分析樣品。

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Triple-TOF-MS對(duì)“發(fā)汗”前后續(xù)斷的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，檢測(cè)出52種共有成分，主要為三萜皂苷、環(huán)烯醚萜苷、酚酸類等成分，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)續(xù)斷“發(fā)汗”前后，在化學(xué)成分含量上存在一定差異，也許正是這些變化的成分在影響著續(xù)斷發(fā)汗前后的質(zhì)量差異。

課題組前期比較了續(xù)斷發(fā)汗前后對(duì)大鼠脛骨骨折修復(fù)影響，發(fā)現(xiàn)續(xù)斷“發(fā)汗”前后對(duì)大鼠脛骨骨折藥效差異無顯著性，并研究了續(xù)斷發(fā)汗前后對(duì)人成骨樣MG-63細(xì)胞、幼鼠成骨細(xì)胞增殖的影響，藥理研究結(jié)果表明，“發(fā)汗”組較未“發(fā)汗”組的藥理活性降低[23]。同時(shí)建立了續(xù)斷“發(fā)汗”前后與成骨細(xì)胞增殖、人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖分化藥效的譜效關(guān)系，研究表明，川續(xù)斷皂苷VI、綠原酸、馬錢苷可能是影響續(xù)斷發(fā)汗后影響細(xì)胞增殖分化作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[24]。

因此，結(jié)合課題組前期研究，續(xù)斷在“發(fā)汗”后較多的化學(xué)成分含量降低，且影響成骨細(xì)胞增殖、MG-63細(xì)胞增殖分化藥效主要有效成分，包括川續(xù)斷皂苷VI、綠原酸、馬錢苷等成分含量在發(fā)汗后均顯著降低，推測(cè)這些成分含量降低與促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、MG-63細(xì)胞增殖分化藥效降低有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)探究了產(chǎn)地加工“發(fā)汗”對(duì)續(xù)斷化學(xué)成分的影響，為探究續(xù)斷“發(fā)汗”前后化學(xué)成分物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)，并為全面評(píng)價(jià)續(xù)斷發(fā)汗前后的藥材質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。