細(xì)胞實(shí)驗(yàn) | 你數(shù)的細(xì)胞靠譜嗎？
細(xì)胞培養(yǎng)是基礎(chǔ)科研的基本功，是實(shí)驗(yàn)中最常見(jiàn)的試驗(yàn)。此實(shí)驗(yàn)很友好，非“玄學(xué)”，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，有時(shí)需要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，雖然試驗(yàn)比較簡(jiǎn)單，但是經(jīng)常暈頭轉(zhuǎn)向、數(shù)到眼瞎，而且萬(wàn)一一個(gè)不小心被其他人打斷了思路，分分鐘前功盡棄。今天我們就來(lái)聊聊細(xì)胞計(jì)數(shù)那些事兒。
01
制備細(xì)胞懸液
對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，我們需要首先使用胰酶消化的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面脫落；根據(jù)需要加入合適體積的培養(yǎng)基，將細(xì)胞進(jìn)行中和及稀釋，以得到均質(zhì)的細(xì)胞懸液；要求盡可能將細(xì)胞吹打散開(kāi)，不要?dú)埩羧魏渭?xì)胞團(tuán)。
Tips：有些易結(jié)團(tuán)的，用手指彈打外壁，也達(dá)不到吹散目的，建議至少用吸管吹打10次左右。
02
準(zhǔn)備血細(xì)胞計(jì)數(shù)器
使用70%乙醇將蓋玻片和血細(xì)胞計(jì)數(shù)器清潔干凈；將蓋玻片潤(rùn)濕（使用水或呼一口氣，目的是使蓋玻片與血細(xì)胞計(jì)數(shù)器接觸更緊密，易于粘連），并覆蓋至血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上；
03
臺(tái)盼蘭染色（可選）
如果需要計(jì)算細(xì)胞的活力，則需要將細(xì)胞懸液和0.4%臺(tái)盼蘭等體積混合；室溫孵育，使臺(tái)盼蘭完全進(jìn)入死細(xì)胞，使死細(xì)胞著藍(lán)色。
Tips：建議臺(tái)盼蘭溶液務(wù)必0.22um過(guò)濾，過(guò)濾后的0.4%臺(tái)盼蘭溶液可以低溫保存1個(gè)月左右；與細(xì)胞1:1混合的時(shí)間不要超過(guò)10min，盡可能控制在5分鐘內(nèi)，混勻后，混合現(xiàn)用。
04
血細(xì)胞計(jì)數(shù)器加樣
使用吸管將細(xì)胞懸液或細(xì)胞/臺(tái)盼蘭混合液滴加到血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)池的邊緣。此時(shí)液滴將在虹吸的作用下進(jìn)入蓋玻片下方的計(jì)數(shù)池；以同樣的方式在另一側(cè)的計(jì)數(shù)池中也加入細(xì)胞懸液；將計(jì)數(shù)板放置幾分鐘使細(xì)胞完全擴(kuò)散，同時(shí)用吸水紙吸除多余的液體。
05
細(xì)胞計(jì)數(shù)
在100倍顯微鏡下，移動(dòng)計(jì)數(shù)板將視野對(duì)準(zhǔn)計(jì)數(shù)板的中央大方塊，該方塊四周有一圈3條平行線包圍，中間有密集的網(wǎng)格。中央方塊區(qū)差不多剛好可以填滿整個(gè)視野（下圖中標(biāo)記的3號(hào)位置），血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的示意圖：
圖1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的示意圖
分別計(jì)數(shù)大方格1、2、4、5中的細(xì)胞數(shù)(為降低計(jì)數(shù)誤差，最好將細(xì)胞濃度調(diào)整為20-50個(gè)/大方格)，并重復(fù)記錄另一側(cè)計(jì)數(shù)池中的細(xì)胞數(shù)，總計(jì)8個(gè)大方塊，然后取均值。
計(jì)數(shù)的方法是只計(jì)算上邊和左邊壓線的細(xì)胞，而右邊和下邊壓線的細(xì)胞不予計(jì)算（圖2，總體原則是“計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右”，判斷標(biāo)準(zhǔn)為是否接觸三條邊線的中間線）。如果有多個(gè)細(xì)胞沒(méi)有吹散成團(tuán)存在，此時(shí)只可記為一個(gè)細(xì)胞。如果團(tuán)塊很多，則可能需要重新吹打甚至消化直至絕大多數(shù)細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞。
圖2 計(jì)算原則
06
計(jì)算細(xì)胞數(shù)
圖3規(guī)格為1mm×1mm×0.1mm的血球計(jì)數(shù)板
如果選用規(guī)格為1mm×1mm×0.1mm的血球計(jì)數(shù)板，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器每個(gè)大方塊可以容納的體積：
1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 = 10-4 cm3 = 10-4mL，也即每個(gè)大方塊的體積為萬(wàn)分之一毫升，因此在計(jì)算每毫升液體中的細(xì)胞數(shù)時(shí)需要乘以104。
在常規(guī)沒(méi)有使用臺(tái)盼蘭染色時(shí)，可以以下面公式計(jì)算每毫升樣品中細(xì)胞的個(gè)數(shù)：
每毫升樣品中細(xì)胞的個(gè)數(shù) = 每個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞的平均數(shù) × 細(xì)胞稀釋倍數(shù)×104。
如果使用了臺(tái)盼蘭染色，還需要計(jì)算活細(xì)胞的百分率：活細(xì)胞百分率(%)= 臺(tái)盼蘭拒染細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100此時(shí)活細(xì)胞數(shù)的計(jì)算公式為：
每毫升樣品中活細(xì)胞的個(gè)數(shù) = 每個(gè)大方格中細(xì)胞的平均數(shù)×活細(xì)胞比率×細(xì)胞稀釋倍數(shù)×2×104。
注：乘2是由于在臺(tái)盼蘭染色時(shí)，進(jìn)行了等體積混合，相當(dāng)于稀釋了一倍。
所以盡管使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板手工計(jì)數(shù)細(xì)胞過(guò)程十分繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)者操作者的要求也比較嚴(yán)格，現(xiàn)在也已有很多自動(dòng)化的細(xì)胞計(jì)數(shù)器/儀，但對(duì)于科學(xué)研究中遇到的各種細(xì)胞而言，手工計(jì)數(shù)仍然是最簡(jiǎn)便易行的方法而被廣大實(shí)驗(yàn)室采用。
