成功完成Western Blot檢測(cè)，必須滿足4個(gè)條件：

1.?凝膠洗脫：轉(zhuǎn)移期間蛋白質(zhì)必須從凝膠中洗脫出來(lái)，如果蛋白質(zhì)還截留在凝膠中，將無(wú)法在膜上進(jìn)行分析

2.?吸附到膜上：在轉(zhuǎn)移過(guò)程中蛋白質(zhì)必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附，將無(wú)法在膜上進(jìn)行分析

3.?處理期間仍截留在膜上：在轉(zhuǎn)移后的處理過(guò)程中蛋白質(zhì)必須保持吸附在印跡膜上

4.?處理過(guò)程中可接近：被吸附的蛋白質(zhì)必須能夠與檢測(cè)試劑接觸，如果蛋白質(zhì)被掩蓋則無(wú)法檢測(cè)

成功進(jìn)行WB檢測(cè)，則設(shè)置合適正確的對(duì)照是必不可少的，只要正確設(shè)置了這些對(duì)照，即可快速和準(zhǔn)確的找到WB的問(wèn)題所在，并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性！一般需要設(shè)置的對(duì)照如下：

·?陽(yáng)性對(duì)照：明確表達(dá)檢測(cè)蛋白的組織或細(xì)胞，用于檢測(cè)抗體的工作效率

·?陰性對(duì)照：明確不表達(dá)檢測(cè)蛋白組織或細(xì)胞，用于檢測(cè)抗體的特異性

·?二抗對(duì)照：不加一抗，用于檢測(cè)二抗的特異性

·?內(nèi)參對(duì)照：檢測(cè)標(biāo)本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)

·?空白對(duì)照：不加一抗和二抗；用于檢測(cè)膜的性質(zhì)和封閉的效果

WB檢測(cè)基本過(guò)程

1、獲取細(xì)胞或組織裂解物

1)根據(jù)檢測(cè)蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：

亦可購(gòu)買(mǎi)商業(yè)化的蛋白提取試劑盒來(lái)保證標(biāo)本制備的質(zhì)量

2)選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性！

2、蛋白定量

常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCAassay。定量后，可根據(jù)情況將標(biāo)本保存在-20°C /-80°C備用，進(jìn)行免疫沉淀（IP）或者直接進(jìn)行電泳分離蛋白

3、電泳分離蛋白質(zhì)

根據(jù)待測(cè)蛋白狀態(tài)確定電泳條件：

根據(jù)待測(cè)蛋白分子量大小確定凝膠濃度

4、轉(zhuǎn)膜

根據(jù)不同的檢測(cè)目的和待測(cè)蛋白的特性，選擇合適的膜類(lèi)型。常用的轉(zhuǎn)移膜類(lèi)型有：PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率最高。各種膜的技術(shù)參數(shù)及比較如下：

5、封閉

去掉膜上多余的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS

6、一抗孵育

一抗的選擇成功與否，是整個(gè)WB實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵：選擇一抗有以下幾個(gè)注意點(diǎn)：

·?選擇適合檢測(cè)標(biāo)本種屬的一抗（說(shuō)明書(shū)有驗(yàn)證）

·?選擇適用于WB實(shí)驗(yàn)方法的一抗（說(shuō)明書(shū)有驗(yàn)證）

·?選擇單克隆抗體或者經(jīng)過(guò)親和純化的多克隆抗體

一抗的保存和使用：

·?根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求條件進(jìn)行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，絕對(duì)避免反復(fù)凍融。

·?抗體的工作液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，在4度保存最好不要超過(guò)2周

·?根據(jù)說(shuō)明書(shū)推薦濃度使用TBST稀釋一抗。由于實(shí)驗(yàn)室條件和檢測(cè)方法等的差異，說(shuō)明書(shū)推薦的稀釋比例只作參考，需要在說(shuō)明書(shū)推薦的濃度周邊進(jìn)行多個(gè)濃度梯度的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，然后選擇信噪比最好的抗體濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果說(shuō)明書(shū)沒(méi)有推薦濃度，可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索最佳稀釋度（1:100-1:3000）。

·?孵育條件：推薦4°C孵育過(guò)夜（一般大于18個(gè)小時(shí)），根據(jù)抗體親和力不同孵育時(shí)間有所區(qū)別

內(nèi)參的選擇和使用：WB過(guò)程監(jiān)測(cè)以及目的蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)！

WB常用內(nèi)參及其技術(shù)參數(shù)：

7、二抗孵育

根據(jù)說(shuō)明書(shū)推薦濃度使用TBST稀釋一抗。如果說(shuō)明書(shū)沒(méi)有推薦濃度，可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索最佳稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時(shí)

8、底物孵育

選擇顯色或者化學(xué)發(fā)光底物。一般傾向于化學(xué)發(fā)光，靈敏度高且背景低，節(jié)省抗體用量

9、結(jié)果分析和檢測(cè)

凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)或者暗室曝光到膠片

?Note：從封閉開(kāi)始，每步之間都需要用TBST進(jìn)行洗滌，3次，每次5min

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10、WB常見(jiàn)問(wèn)題及技術(shù)要點(diǎn)

WB過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題及可能原因分析?

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