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Rho 激活劑 II的用途及生物活性檢測說明

2023-11-22 16:01 作者:艾美捷  | 我要投稿

G-switch?系列小G蛋白工具系列的開發(fā)側(cè)重于創(chuàng)建針對內(nèi)源性Rho家族蛋白和信號通路的高效試劑。與依賴于過表達或敲降目標(biāo)蛋白的方法(例如,DNA轉(zhuǎn)染顯性負性或?;钚訰ho突變體,RNAi敲降)相比,G-switch?試劑能夠迅速作用于內(nèi)源性目標(biāo)蛋白(根據(jù)產(chǎn)品而定,時間范圍為分鐘至小時),從而優(yōu)化產(chǎn)生更具生理學(xué)相關(guān)性的反應(yīng)的機會。G-switch?產(chǎn)品系列包括直接和間接調(diào)節(jié)Rho家族信號傳導(dǎo)的試劑,因此提供了廣泛的機制工具來研究這些關(guān)鍵的細胞功能。請訪問Cytoskeleton公司的網(wǎng)站獲取最新的G-switch?信息。 ? CN03的活性位點基于細菌細胞毒性壞死因子(CNF)毒素的催化結(jié)構(gòu)域。催化結(jié)構(gòu)域與一種專有的細胞穿透基團共價結(jié)合。CN03通過脫氨酰胺化位于這些GTP酶的Switch II區(qū)域的谷氨酰胺-63來激活Rho GTP酶亞型(1)。這種修飾將谷氨酰胺-63轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼幔瑥亩钄嗔斯逃泻虶AP刺激的GTP酶活性,導(dǎo)致Rho的?;钚裕?)。在添加到培養(yǎng)基后的2-4小時內(nèi),CN03顯著增加了GTP結(jié)合的RhoA水平。此外,這種激活劑的有針對性作用使其比經(jīng)典的間接激活劑(例如,LPA)更具吸引力,后者同時激活其他信號通路(例如,Ras、PI3K和PLC)。 ? 艾美捷Rho?激活劑?II用途包括: Rho通路激活劑 研究Rho活化對細胞運動的影響 研究Rho活化對肌動蛋白細胞骨架重排的影響 研究?Rho?激活對與其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路串?dāng)_的影響 ?

材料: CN03是在細菌表達系統(tǒng)中制備的。重組蛋白的分子量為118 kDa,并在其氨基端含有六個組氨酸殘基(His標(biāo)簽)。經(jīng)過固定金屬親和層析(圖1),已經(jīng)純化至80%以上的純度。每個小瓶中提供的是白色凍干固體,含有20 μg的CN03蛋白。該物質(zhì)已經(jīng)在RhoA激活的生物學(xué)檢測中顯示出活性(見下文)。在RhoA激活的生物學(xué)檢測中,一個包含單點突變的蛋白質(zhì)失活突變體顯示出零活性(未顯示數(shù)據(jù))。 ? 儲存和重溶: 在常溫下運輸。凍干的蛋白質(zhì)可以在4°C下干燥儲存6個月。CN03的凍干顆??赡芸雌饋硭缮⑶逸p包裝,但這不會影響CN03的質(zhì)量或性能。為了重溶,簡單離心以收集管底的產(chǎn)物,然后將每個小瓶中的產(chǎn)物重懸于200 μl無菌水中,放在冰上靜置10分鐘,輕輕上下吸移混勻,得到0.1 μg/μl的濃度。在使用之前,CN03應(yīng)進一步與無血清培養(yǎng)基稀釋至0.25至5 μg/ml的濃度(由用戶確定,參見圖2和表1)。通常,在3小時內(nèi),1 μg/ml的濃度能夠在多種細胞類型中產(chǎn)生強大的RhoA激活。重溶的激活劑可以在液氮中快速冷凍,并在–70°C下儲存長達6個月。 ? Rho?激活劑?II生物活性檢測: 在37°C孵育2小時后,CN03(1 μg/ml /?相當(dāng)于10 μl/ml)顯示出在瑞士3T3細胞中引發(fā)了十倍的RhoA激活(圖2和圖3)和應(yīng)力纖維誘導(dǎo)(圖4)。在表1中詳細介紹了在幾種細胞類型中激活Rho的推薦條件。 ? 活性檢測方法:瑞士3T3細胞激活 1.?在兩個含有10 ml DMEM / 10%胎牛血清(FBS)的10 cm2培養(yǎng)皿中,將瑞士3T3細胞以37°C / 5% CO2培養(yǎng)至30%的密度。 2.?將培養(yǎng)基更換為DMEM / 1% FBS,饑餓細胞24小時,然后轉(zhuǎn)移到DMEM / 0% FBS培養(yǎng)24小時。 3.?簡要離心CN03管,使其沉淀在管底。 4.?用200 μl無菌水(0.1 μg/μl)重溶CN03-請參見上面的儲存和重溶部分。 5.?用溫暖的DMEM將CN03稀釋至1 μg/ml。 6.?吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,將含有CN03的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到一個培養(yǎng)皿中。 7.?只向第二個培養(yǎng)皿中加入溫暖的DMEM。這是對照組,代表未刺激的細胞。 8.?在37°C和5% CO2下孵育2小時。通過G-LISA?分析(Cat. # BK124;圖2和圖3)或細胞形態(tài)學(xué)(Cat. # PHDG1;圖4)來檢測Rho活性。

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Rho?激活劑?II文獻參考:? 1. Schmidt G., et al. 1997. Gln 63 of Rho is deamidated by Escherichia coli cytotoxic necrotizing factor-1. Nature. 387, 725-729. 2. Flatau G., et al. 1997. Toxin-induced activation of the G protein p21 Rho by deamidation of glutamine. Nature. 387, 729-733.

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