化療作為全身轉(zhuǎn)移傾向腫瘤或轉(zhuǎn)移性晚期腫瘤的主要臨床治療方法，一般通過(guò)使用化學(xué)藥物抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來(lái)達(dá)到治療效果。然而，腫瘤細(xì)胞對(duì)一種或多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性的途徑有很多，包括減少藥物攝取或增加藥物外排、激活DNA修復(fù)、上調(diào)新陳代謝、刺激解毒途徑等，從而成為傳統(tǒng)化療成功的主要障礙。

隨著耐藥研究的深入，腫瘤異質(zhì)性、腫瘤微環(huán)境、遺傳因素等多種機(jī)制與化療耐藥的發(fā)生密切相關(guān)。最近，細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)失衡被報(bào)道與耐藥有關(guān)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞的氧化還原水平被打破時(shí)，其氧化應(yīng)激防御能力可以通過(guò)上調(diào)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Gpx4)和谷胱甘肽(GSH)的水平而顯著增強(qiáng)。腫瘤細(xì)胞內(nèi)的微環(huán)境通過(guò)遷移有毒的活性氧，重新達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，從而逐漸導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。因此，積極改變腫瘤細(xì)胞內(nèi)的氧化環(huán)境是逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的有效策略。

鐵死亡是一種細(xì)胞內(nèi)鐵依賴的細(xì)胞死亡形式，與氧化應(yīng)激的產(chǎn)生有關(guān)。鐵死亡時(shí)脂質(zhì)過(guò)氧化(LPO)的積累破壞了細(xì)胞內(nèi)氧化還原動(dòng)態(tài)平衡，從而影響腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。因此，來(lái)自南京工業(yè)大學(xué)的宋雪嬌、董曉臣和南京醫(yī)科大學(xué)的徐華娥共同提出了一種基于LPO積聚的鐵死亡策略，通過(guò)抑制SLC3A2蛋白和失活的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(Gpx4)來(lái)減少谷胱甘肽的生成，以逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的化療耐藥性?；阼F死亡誘導(dǎo)納米反應(yīng)器(Au/Fe-GA/Sorafenib@PEG)的芬頓反應(yīng)不僅在激光照射下產(chǎn)生羥基自由基(·OH)實(shí)現(xiàn)LPO的積累，而且還耗盡GSH以增加LPO的積累。同時(shí)，索拉非尼抑制細(xì)胞對(duì)半胱氨酸的攝取，導(dǎo)致GSH合成減少，Gpx4失活。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，AFG/SFB@PEG+激光組可以滅活Gpx4，增強(qiáng)的鐵死亡可以通過(guò)自救逆轉(zhuǎn)由于細(xì)胞內(nèi)Gpx4水平持續(xù)上調(diào)而導(dǎo)致的化療耐藥性。本研究提出了鐵死亡逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制和可行性，為化療耐藥腫瘤的治療提供了一種有前景的策略。相關(guān)論文“Potent nanoreactor-me diate d ferroptosis-based strategy for the reversal of cancer chemoresistance to Sorafenib?”于2023年2月1日發(fā)表于雜志《Acta Biomaterialia》上。

1.?AFG/SFB@PEG的合成與表征

如方案1 a所示，合成了AFG/SFB@PEG納米反應(yīng)器。用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)AFG/SFB@PEG納米反應(yīng)器的尺寸和形貌進(jìn)行了表征，如圖1a和b所示。與HAuCl4·3H2O和Au/Fe相比，AFG和AFG/SFB@PEG在整個(gè)可見(jiàn)光和近紅外區(qū)域都有很強(qiáng)的吸收，600 nm處的特征吸收峰可能是由于Fe-GA絡(luò)合物的d-d電子躍遷(圖1c)。此外，通過(guò)Zeta電位測(cè)試(圖1d)，成功地合成了AFG/SFB@PEG。此外，用X射線光電子能譜(XPS)測(cè)定了Fe的化學(xué)組成和價(jià)態(tài)。AFG/SFB@PEG的XPS分析顯示出可歸屬于Fe、F、O、N、C、Cl和Au的特征峰(圖1e)。此外，F(xiàn)e 2p的XPS譜在711.28 eV和724.97 eV附近出現(xiàn)兩個(gè)較強(qiáng)的峰，分別對(duì)應(yīng)于Fe?2p3/2和Fe?2p1/2，可歸因于Fe3+(圖1f)。如圖1g所示，F(xiàn)e-GA和AFG/SFB@PEG分別照射在808 nm激光(1W/cm2)上。經(jīng)過(guò)五個(gè)循環(huán)的加熱和冷卻操作，升溫速度和最高溫度沒(méi)有明顯下降，這表明Fe-GA和AFG/SFB@PEG具有很高的光穩(wěn)定性。如圖1h&i所示，當(dāng)加入過(guò)氧化氫時(shí)，AFG和AFG/SFB@PEG顯示出典型的·OH特征峰1：2：2：1。

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方案1 AFG/SFB@PEG納米反應(yīng)器的合成

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圖1 AFG/SFB@PEG納米反應(yīng)器的表征

2. AFG/SFB@PEG體外抗腫瘤作用的研究

進(jìn)一步研究AFG/SFB@PEG對(duì)4T1乳腺癌細(xì)胞攝取的有效性，樣品系列均用Ce6標(biāo)記，并在激光共聚焦掃描顯微鏡分析(CLSM)前與4T1細(xì)胞孵育1、2和4h。Ce6的強(qiáng)紅色熒光強(qiáng)度可以隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而觀察到，這表明AFG/SFB@PEG有效地被細(xì)胞攝取(圖2a)。然后，用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞存活率分析細(xì)胞內(nèi)鐵死亡引起的氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞活力的影響。T1細(xì)胞分別與AFG和AFG/SFB@PEG共同孵育。在無(wú)激光照射的情況下，AFG處理的細(xì)胞存活率低于AFG/SFB@PEG處理組，表明索拉非尼的化療作用。值得注意的是，激光照射的AFG/SFB@PEG組在所有試驗(yàn)濃度下都表現(xiàn)出比AFG組更高的細(xì)胞毒效應(yīng)，甚至在60?μg/mL的濃度下殺死了大約74%的癌細(xì)胞(圖2b&c)。圖2d的結(jié)果表明，AFG具有芬頓效應(yīng)，與對(duì)照組相比有一定程度的細(xì)胞殺傷作用。

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圖2 AFG/SFB@PEG體外抗腫瘤作用的研究

3. 體外鐵死亡分析

進(jìn)一步評(píng)估了AFG/SFB@PEG觸發(fā)的癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激。為了定量評(píng)價(jià)不同處理對(duì)GSH和NADPH的消耗、GSH濃度和NADPH濃度。與對(duì)照組或其他處理組相比，AFG/SFB@PEG+L處理的4T1細(xì)胞的GSH和NADPH濃度顯著降低(圖3a和b)。如圖3c所示，AFG/SFB@PEG+L處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)GSH相關(guān)Gpx4的活性明顯受到抑制，表明AFG/SFB@PEG可以調(diào)節(jié)Gpx4的表達(dá)，并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鐵死亡。由于鐵死亡不同于一般的細(xì)胞死亡形式，如細(xì)胞凋亡、自噬等，激光治療后細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)減少，從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡(圖3g)。隨后，進(jìn)一步評(píng)估了AFG/SFB@PEG對(duì)細(xì)胞磷脂的氧化應(yīng)激作用。倒置熒光顯微鏡顯示了AFG/SFB@PEG+L處理4h內(nèi)增強(qiáng)的細(xì)胞DCF熒光信號(hào)(圖3h)，說(shuō)明了ROS的產(chǎn)生。此外，AFG/SFB@PEG在808 nm激光下加速了外源ROS的產(chǎn)生，這可能直接對(duì)線粒體產(chǎn)生強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致線粒體功能障礙(圖3i)。如圖3d所示，AFG/SFB@PEG+L處理的細(xì)胞產(chǎn)生的丙二醛含量是對(duì)照組的3.88倍，表明LPO的積累激活了鐵死亡。此外，與對(duì)照組相比，Liperfluo染料染色的各組細(xì)胞均能發(fā)出綠色熒光，證明LPO能在細(xì)胞內(nèi)有效積聚(圖3j)。為了進(jìn)一步評(píng)估LPO的產(chǎn)生，在AFG/SFB@PEG處理后，用LPO抑制劑Lip-1與細(xì)胞孵育，圖3e觀察到氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷明顯減少。此外，添加維生素E(VE)處理細(xì)胞，由于VE清除脂質(zhì)過(guò)氧化自由基的能力，可以減輕AFG/SFB@PEG引起的細(xì)胞損傷(圖3f)。所有這些結(jié)果證實(shí)了癌細(xì)胞內(nèi)積累的ROS主要是AFG/SFB@PEG誘導(dǎo)的LPO。

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圖3 體外鐵死亡分析

4. 體內(nèi)鐵死亡分析

如圖4a和圖4b所示，在808 nm激光照射下，注射AFG/SFB@PEG的小鼠腫瘤部位的溫度可達(dá)48℃，而對(duì)照組的溫度僅為29℃。在治療期間，所有小鼠的體重變化均可忽略不計(jì)，證實(shí)了這些治療對(duì)小鼠健康的負(fù)面影響可以忽略不計(jì)(圖4c)。連續(xù)16天觀察各組腫瘤生長(zhǎng)情況，并于圖4d顯示抗腫瘤作用。取小鼠腫瘤組織，蘇木精-伊紅(H&E)染色，驗(yàn)證不同治療方法對(duì)腫瘤組織的損傷情況。與未經(jīng)激光照射的腫瘤相比，AFG+L組和AFG/SFB@PEG+L組的腫瘤組織切片顯示細(xì)胞完整性不全，表明腫瘤細(xì)胞損傷嚴(yán)重(圖4e)。

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圖4 體內(nèi)鐵死亡分析

5. 體內(nèi)和體外鐵死亡逆轉(zhuǎn)化療耐藥

如圖5a和b所示，用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法證實(shí)，SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)索拉非尼作用后，半數(shù)抑制濃度(IC50)值升高，表明該細(xì)胞對(duì)索拉非尼誘導(dǎo)的化療具有耐藥性。為了定量地證明鐵死亡可以通過(guò)下調(diào)GSH和Gpx4來(lái)逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性，分別定量檢測(cè)了索拉非尼和AFG/SFB@PEG藥物處理的SMMC-7721S細(xì)胞中GSH、NADPH和Gpx4的濃度(圖5c和e)。如圖5f&g所示，經(jīng)索拉非尼處理的SMMC-7721s細(xì)胞表現(xiàn)出較高的P-gp和Gpx4蛋白表達(dá)，而AFG/SFB@PEG處理的SMMC-7721s細(xì)胞P-gp和Gpx4蛋白表達(dá)因AFG/SFB@PEG引起的鐵死亡而下調(diào)。此外，還進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證鐵死亡可以逆轉(zhuǎn)化療耐藥。AFG+L或AFG/SFB@PEG+L組小鼠腫瘤體積縮小，與其他組相比，AFG/SFB@PEG+L組腫瘤體積縮小更明顯(圖5h&i)。值得注意的是，結(jié)合免疫印跡和免疫熒光圖像分析(圖5j和k)，P-gp和Gpx4蛋白在索拉非尼治療的腫瘤組織中在實(shí)體瘤治療16天后高表達(dá)。免疫熒光圖像顯示，索拉非尼治療的腫瘤組織中SLC3A2蛋白的表達(dá)明顯低于其他治療組，提示索拉非尼可能通過(guò)抑制SLC3A2蛋白對(duì)半胱氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)而抑制GSH的合成，導(dǎo)致Gpx4的表達(dá)下降(圖5k)。

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圖5 體內(nèi)和體外鐵死亡逆轉(zhuǎn)化療耐藥

總之，研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種鐵死亡誘導(dǎo)的納米反應(yīng)器，它通過(guò)雙通道有效地積聚在腫瘤部位。釋放的AFG通過(guò)參與磷脂過(guò)氧化過(guò)程，持續(xù)催化產(chǎn)生高細(xì)胞毒性·OH，進(jìn)而誘導(dǎo)LPO的形成；索拉非尼抑制SLC3A2蛋白對(duì)胱氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致GSH耗竭，Gpx4失活，進(jìn)而引起鐵死亡。深入分析表明，鐵死亡導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平紊亂，有效下調(diào)P-gp、Gpx4和SLC3A2的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)化療耐藥，使細(xì)胞對(duì)索拉非尼持續(xù)敏感。鐵死亡誘導(dǎo)的納米反應(yīng)器通過(guò)雙通道逆轉(zhuǎn)化療耐藥性，有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。

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