導(dǎo)語

發(fā)生過程中，平滑肌細(xì)胞（SMC）在動脈粥樣硬化刺激下，增殖、去分化和遷移到內(nèi)膜病變中。其轉(zhuǎn)化成其他表型的細(xì)胞在冠心?。╟oronary artery disease，CAD）發(fā)病中起到了重要作用，包括轉(zhuǎn)化成類成纖維細(xì)胞、類軟骨細(xì)胞等，這些細(xì)胞組成了動脈粥樣斑塊的主要細(xì)胞群。

研究問題

·表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄機(jī)制如何介導(dǎo)SMC轉(zhuǎn)化為其他細(xì)胞

·SMC及轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞如何影響冠心病的發(fā)生

研究技術(shù)

10X?單細(xì)胞RNA測序、10X單細(xì)胞ATAC-seq、ChIP-seq、IHC

研究內(nèi)容

作者采用CRISPR-Cas9技術(shù)，鑒定出遠(yuǎn)端調(diào)控Zeb2表達(dá)的超級增強(qiáng)子。Zeb2通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)重塑，抑制Notch和TGFβ信號通路，改變SMC表觀遺傳軌跡，調(diào)控SMC表型轉(zhuǎn)化。Zeb2的SMC特異性缺失導(dǎo)致SMC無法關(guān)閉收縮的表達(dá)，呈現(xiàn)出成纖維細(xì)胞樣（fibromyocyte，F(xiàn)MC）表型，加速了軟骨肌細(xì)胞（chondromyocyte，CMC）的形成，反映了人類冠狀動脈中高風(fēng)險動脈粥樣硬化斑塊的特征。

研究路線

研究結(jié)果

1.?CAD相關(guān)的染色體2q.22.3變異調(diào)控ZEB2表達(dá)

既往全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)染色體2q.22.3與CAD的發(fā)病率顯著相關(guān)（Fig?1A），該區(qū)域距離最近的基因?yàn)閆EB2。GWAS數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，2q.22.3區(qū)域的SNP單倍型塊與CAD風(fēng)險顯著相關(guān)，且在物種間保守（Fig 1B），并可以劃分為6個高保守區(qū)域（Fig 1C）。采用人SMC組織進(jìn)行H3K27ac ChIP-seq發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域?qū)儆诠δ苄驮鰪?qiáng)子（Fig 1D），Hi-C證實(shí)其行成loop結(jié)構(gòu)結(jié)合ZEB2啟動子（Fig 1D）。GWAS分析eQTL數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域的SNP與CAD發(fā)生相關(guān)，與ZEB2的表達(dá)也明顯相關(guān)（Fig 1E）。使用CRISPR-Cas9敲除該區(qū)域后（Fig 1F），ZEB2表達(dá)顯著降低（Fig 1G）。使用dCas9-KRAS特異性分別抑制6個保守區(qū)域的功能（Fig 1H），發(fā)現(xiàn)其中3個區(qū)域調(diào)控ZEB2表達(dá)（Fig 1I）。

2.?SMC表型轉(zhuǎn)化中Zeb2表達(dá)激活

為了研究在動脈粥樣硬化損傷中，表達(dá)Zeb2的細(xì)胞，作者使用譜系追蹤的動脈粥樣硬化小鼠模型的主動脈根部進(jìn)行單細(xì)胞測序（Fig 2A）。無動脈粥樣硬化時，Zeb2表達(dá)于巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中，譜系示蹤的SMC細(xì)胞中不表達(dá)Zeb2（Fig 2B-2D）。值得注意的是，在動脈粥樣硬化斑塊中，隨著SMC轉(zhuǎn)化，Zeb2表達(dá)逐漸激活（Fig 2C）。RNA原位雜交發(fā)現(xiàn)，Zeb2表達(dá)于斑塊帽子結(jié)構(gòu)下方的譜系示蹤SMC細(xì)胞中（Fig 2E-2G）。

為了鑒定使用ZEB2增強(qiáng)子的細(xì)胞，及了解Zeb2如何調(diào)控表觀基因組，作者進(jìn)行了單細(xì)胞ATAC-seq（scATC-seq）。采用擬表達(dá)矩陣進(jìn)行降維聚類，鑒定出6種細(xì)胞（Fig 2H）。不同類型的細(xì)胞中可視化2q.22.3區(qū)域的染色質(zhì)開放程度，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中該區(qū)域處于關(guān)閉狀態(tài)，轉(zhuǎn)化的SMC細(xì)胞中處于開放狀態(tài)（Fig 2I）。整合scRNA-seq和scATAC-seq中的SMC細(xì)胞數(shù)據(jù)，降維分析發(fā)現(xiàn)SMC可以聚類為靜息態(tài)和轉(zhuǎn)化態(tài)SMC（Fig 2J）。Monocle軟件構(gòu)建SMC演化狀態(tài)（Fig 2K），平滑肌細(xì)胞起始于收縮基因高表達(dá)狀態(tài)，隨著SMC轉(zhuǎn)化為FMC，其表達(dá)量逐漸降低（Fig 2L）。Zeb2表達(dá)伴隨于Zeb結(jié)合位點(diǎn)的可及性降低（Fig 2M-2O）。隨著演化軌跡，出現(xiàn)CMC細(xì)胞時，Zeb2表達(dá)丟失，Zeb結(jié)合基序的可及性恢復(fù)。這些結(jié)果表明，Zeb2作為表觀遺傳抑制因子，結(jié)合染色質(zhì)后，會關(guān)閉其結(jié)合區(qū)域的染色質(zhì)可及性（Fig 2P）。

3.?敲除Zeb2特異性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化態(tài)SMC的表觀遺傳軌跡

對SMC細(xì)胞條件性敲除Zeb2的動脈粥樣硬化小鼠進(jìn)行scATAC-seq和scRNA-seq，研究Zeb2調(diào)控SMC轉(zhuǎn)化的機(jī)制（Fig 3A）。scATAC-seq降維聚類發(fā)現(xiàn)（Fig 3B），缺失Zeb2廣泛改變轉(zhuǎn)化態(tài)SMC細(xì)胞的染色質(zhì)可及性（Fig 3C）。SMC細(xì)胞亞群細(xì)分，轉(zhuǎn)化態(tài)SMC主要存在于Zeb2敲除的樣本中（Fig?3D-3E），成熟SMC標(biāo)記基因Cnn1等的染色質(zhì)可及性增加（Fig?3F-3G），意味著Zeb2在轉(zhuǎn)化態(tài)SMC中具有抑制成熟SMC標(biāo)記基因的作用，還可能抑制SMC轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞表型。差異開放區(qū)域也富集了Notch和TGFβ的效應(yīng)因子Rbpj和Smad結(jié)合基序（Fig 3H），Zeb2的表達(dá)與Notch靶基因的表達(dá)也呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系（Fig 3I）。GREAT算法發(fā)現(xiàn)，Zeb2最可能的靶基因富集于EMT相關(guān)通路和TGFβ信號通路（Fig?3J），說明Zeb2可直接調(diào)控TGFβ響應(yīng)基因。

4.?SMC特異性敲除Zeb2降低斑塊中的轉(zhuǎn)化態(tài)SMC細(xì)胞

scRNA-seq降維聚類發(fā)現(xiàn)，缺失Zeb2只導(dǎo)致轉(zhuǎn)化態(tài)SMC的轉(zhuǎn)錄組和表型變化（Fig 4A-4C）。對譜系追蹤的SMC細(xì)胞亞群細(xì)分，缺失Zeb2顯著降低轉(zhuǎn)化態(tài)SMC細(xì)胞數(shù)目（Fig?4D-4I），總SMC細(xì)胞數(shù)不變的情況下，CMC細(xì)胞百分比增加，F(xiàn)MC細(xì)胞百分比降低（Fig?4H-4I），敲除Zeb2促進(jìn)SMC向CMC轉(zhuǎn)化，類成纖維細(xì)胞的重塑態(tài)SMC基因MMP3和Cxcl12表達(dá)降低（Fig 4K-4N）。RNA原位雜交顯示，Zeb2敲除時，成熟SMC基因Cnn1分布于斑塊帽子區(qū)域（Fig?4O-4R），軟骨標(biāo)記基因Col2a1在靠近纖維帽區(qū)域的斑塊體中的細(xì)胞中表達(dá)（Fig 4S-4T）。

文章結(jié)論

本研究通過GWAS確定了ZEB2作為新的CAD相關(guān)基因，scRNA-seq和scATAC-seq發(fā)現(xiàn)ZEB2特異性調(diào)控SMC細(xì)胞的基因表達(dá)和染色質(zhì)可及性，促進(jìn)SMC轉(zhuǎn)化為FMC，抑制SMC轉(zhuǎn)化為CMC。

參考文獻(xiàn)：

Cheng P, Wirka RC, Shoa Clarke L, Zhao Q, Kundu R, Nguyen T, Nair S, Sharma D, Kim HJ, Shi H, Assimes T, Brian Kim J, Kundaje A, Quertermous T.?ZEB2?Shapes the Epigenetic Landscape of Atherosclerosis. Circulation. 2022 Feb 8;145(6):469-485. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.121.057789. Epub 2022 Jan 6. PMID: 34990206; PMCID: PMC8896308.