重要提示：建議讀完上一篇再閱讀本文，因?yàn)楸疚挠玫搅舜罅可掀械谋尘爸R；為簡便起見，此前出現(xiàn)過的術(shù)語（包括縮寫）將不再展開英文全稱。

? ??某種意義上，本系列的正文現(xiàn)在才開始，因?yàn)槲医K于要細(xì)說RyR2的調(diào)控啦！之前說過，本文中將出現(xiàn)上一篇提到的多數(shù)蛋白，外加一位重要的新朋友——β-腎上腺素受體信號通路。閑話少說，我們要聊的第一個小伙伴位于胞質(zhì)側(cè)，它是最早被發(fā)現(xiàn)的RyR2調(diào)控因子之一，也是功能最具爭議的之一。它就是大名鼎鼎的FKBP12.6，此刻正蜷縮在某個RyR2為它提供的結(jié)合位點(diǎn)當(dāng)中向我們問好。

? ??FKBP12.6有個跟它長得很像的小兄弟叫FKBP12（數(shù)字的含義也是分子量），這倆都是100多氨基酸的小蛋白，前者主要調(diào)控RyR2，后者主要調(diào)控RyR1，——至少有些研究是這樣認(rèn)為的。它們倆屬于親免素（immunophilin），能與某些免疫抑制劑高效結(jié)合，比如雷帕霉素（rapamycin），以及給了它們名字的FK506（也叫他克莫司，tacrolimus）。像其他親免素一樣，F(xiàn)KBP家成員都有肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶（peptidylprolyl isomerase）活性，F(xiàn)KBP12和12.6也不例外。這類酶催化的反應(yīng)超出了本系列的討論范圍，重要的是它對某些蛋白（可以包括它們自己）的正常折疊有著重要影響。不知道它倆這一功能會不會跟RyR2的調(diào)控有關(guān)系？

? ? 言歸正傳。FKBP12.6對RyR2親和力巨高，它的小兄弟FKBP12對RyR1的親和力亦然，以至于后者就是因老是與RyR1一起純化出來才被發(fā)現(xiàn)的。分離純化時RyR1要經(jīng)歷不知多少艱難險阻，只有FKBP12對它不離不棄，它倆的親和力可見一斑。不過，F(xiàn)KBP12對RyR2就冷淡得多了。盡管如此，有人發(fā)現(xiàn)心肌內(nèi)FKBP12濃度比FKBP12.6高，平時大鼠和小鼠心肌中只有10%~20%左右的RyR2是跟FKBP12.6結(jié)合的，所以它倆貢獻(xiàn)誰多誰少還難說呢。一般認(rèn)為，F(xiàn)KBP12.6對RyR2的作用可以用“穩(wěn)定”二字概括，就是說它能防止RyR2在不該開放的時候開放。令人一言難盡的是，許多確鑿的證據(jù)支持這一觀點(diǎn)，但也有幾乎同樣有力的證據(jù)提出異議，甚至懷疑FKBP12.6到底對RyR2有多大作用。即使在那些同意FKBP12.6對RyR2至關(guān)重要的研究當(dāng)中，觀察到的它對RyR2的具體作用也可以大相徑庭。只說做個FKBP12.6敲除的小鼠模型吧，不同的研究就能敲出不同的花樣：有的小鼠心臟結(jié)構(gòu)正常，平時心電圖也正常，應(yīng)激時表現(xiàn)出心律失常；有的小鼠沒有運(yùn)動誘導(dǎo)的心律失常，但表現(xiàn)出雄性特異的心臟肥大；還有的小鼠更過分，居然啥事兒沒有，它們心肌RyR2的功能也正常得很。不同品系小鼠遺傳背景的差異大概對此有貢獻(xiàn)，然而回頭你就會看到遺傳背景也不見得能解釋所有的不一致性。RyR2的單通道實(shí)驗(yàn)更多地支持FKBP12.6能穩(wěn)定RyR2的觀點(diǎn)，可生物體畢竟是個復(fù)雜系統(tǒng)，想用單通道體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來解釋生理現(xiàn)象——尤其是當(dāng)生理現(xiàn)象如此充滿爭議時——到底是件相當(dāng)難的事。

? ? 比起敲除模型，有關(guān)FKBP12.6過表達(dá)模型的爭議還算少，真是謝天謝地。在兔子或小鼠的心肌過表達(dá)FKBP12.6后，舒張期鈣火花的頻率、振幅和持續(xù)時間都減少，提示RyR2的自發(fā)開放受到抑制。同時，SR（肌質(zhì)網(wǎng)）儲鈣量升高，可能是因?yàn)槭鎻埰趶腞yR2漏到胞質(zhì)里的鈣變少了。此外，收縮期鈣瞬變振幅上升，收縮力因而增強(qiáng)，或許跟SR鈣儲量升高有關(guān)系。除細(xì)胞模型之外，還有人做出了只在心肌過表達(dá)FKBP12.6的小鼠模型。這些小鼠心肌的舒張期鈣火花頻率降低了50%、平均振幅和持續(xù)時間反而略有增加，SR鈣儲量基本不變，收縮期鈣瞬變振幅反倒下降了30%。惱人的不一致性似乎從未缺席。不過，研究者們還發(fā)現(xiàn)，相比野生型小鼠，過表達(dá)小鼠更難被異丙腎上腺素注射+快速起搏誘發(fā)出心律失常?？吹竭@兒你或許會眼前一亮，想將之歸因于FKBP12.6對RyR2的穩(wěn)定作用。然而，LTCC（L型鈣通道）和NCX（鈉鈣交換體）也受到了FKBP12.6過表達(dá)的影響——前者電流密度峰值降低了15%，后者蛋白水平下降了18%，而這些都能影響誘發(fā)心律失常的難易?？傊F(xiàn)在多數(shù)證據(jù)傾向于支持FKBP12.6對RyR2具有穩(wěn)定作用，但還是丟不得那句老話：“尚需更多研究?！?/p>

? ? 至此，我所說的所有FKBP12.6的事大都是發(fā)生在它和“平常”的RyR2間的。難道還有不平常的RyR2嗎？當(dāng)然有。如果你還記得上一篇中那幅RyR2超復(fù)合體示意圖的話，或許能想起圖上那個RyR2其中一個亞基上標(biāo)了兩個磷酸化位點(diǎn)。人RyR2這倆位點(diǎn)是2808號和2814號絲氨酸（S2808和S2814），分別是PKA（蛋白激酶A）和CaMKII（鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶II）的磷酸化位點(diǎn)。此外，PKA也能磷酸化2031號絲氨酸（S2031）。RyR2是四聚體，你可以想象一下它每個亞基上三個位點(diǎn)磷酸化狀態(tài)的排列組合。盡管很難精確定義，工作中的RyR2可以粗略分為低磷酸化和高磷酸化兩種狀態(tài)。前者就是我說的“平常”RyR2，在FKBP12.6等因子的調(diào)節(jié)下，它們秉持中庸之道，釋放的鈣既不太少又不過多。后者則多出現(xiàn)在“不平常”的情況下，其時RyR2們變得活躍起來，開放概率（Po）增高、對胞漿鈣的激活更敏感，釋放更多的鈣。有證據(jù)顯示FKBP12.6更容易與此狀態(tài)下的RyR2解離，而這可能在某些心臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起到作用。

? ? 說了半天，這“不平?！钡臓顟B(tài)到底是啥引起的呢？或許你早就猜到了，它就是心肌受到兒茶酚胺刺激的情況，具體點(diǎn)是β受體激活時的情況。（心肌也有α受體，但本文不談它。）眾所周知，我們體內(nèi)擔(dān)任化學(xué)信使的兒茶酚胺類物質(zhì)有多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素，其中常跟心肌碰面的是后兩個，都能激動β受體。學(xué)過藥理或生理的都知道工作心肌的β受體主要是β1亞型，不過書本很少提到正常情況下β1和β2受體的含量比約為7:3。β2好像也不少嘛。它倆下游信號通路不盡相同，本文不討論。話說β1受體激活后，跟它偶聯(lián)的Ga蛋白麻利地活化腺苷酸環(huán)化酶，胞內(nèi)cAMP濃度驟升。這些cAMP結(jié)合到PKA的調(diào)節(jié)亞基上，使催化亞基與之解離并激活。另一方面，β受體通路的運(yùn)作（包括PKA的作用）和心率的上升都可以使心肌胞質(zhì)鈣濃度增加，進(jìn)而激活酶如其名的CaMKII。要是鈣濃度升高的時間再長一點(diǎn)兒，CaMKII還可以磷酸化它自己，活性變得更持久。這倆激酶能磷酸化超多東西，底物范圍有不小的重疊，且作用可以很相似。這一切都使得嚴(yán)格地區(qū)分它們各自的作用無比困難，且有時可能意義不大。除RyR2外，它倆比較有名的底物包括LTCC和受磷蛋白（PLN）。磷酸化對LTCC的影響是增強(qiáng)電流，對PLN則使它失去抑制肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵SERCA2a的能力，相當(dāng)于提高了SR裝載鈣的效率，除適應(yīng)更高頻率的動作電位外還增加了庫存鈣量，變相增強(qiáng)收縮力。不過，要是鈣釋放跟不上節(jié)奏，只靠SERCA2a的努力也沒什么用。這時候就該我們的RyR2出場了。

? ? 其實(shí)我前面撒了個謊，因?yàn)橐谚b定出的PKA磷酸化位點(diǎn)不止S2808和S2031兩個，不過這兩個是最主要的。多數(shù)證據(jù)支持PKA對RyR2的磷酸化整體上具有激活性的作用，在單通道層面表現(xiàn)為提高電導(dǎo)、提高Po（開放概率）、增加RyR2對胞質(zhì)鈣的敏感性等等，在整個ECC（興奮-收縮偶聯(lián)）層面則可表現(xiàn)為增加舒張期鈣火花的頻率、大小和同步程度、提高鈣釋放分?jǐn)?shù)（fractional Ca2+ release,?從SR釋出的鈣占原來SR鈣量的比例）、提高RyR2的偶聯(lián)保真度（coupling fidelity,?LTCC的開放成功誘發(fā)一朵鈣火花的概率），等等。不過PKA在爭議這方面也不是盞省油的燈，比如有人就沒觀察到PKA對ECC有明顯影響，還有報道PKA激活后鈣釋放分?jǐn)?shù)不變甚至降低的。有單通道實(shí)驗(yàn)觀察到被PKA磷酸化了的RyR2會出現(xiàn)“適應(yīng)”現(xiàn)象，也就是開放頻率增加，但每次開放后關(guān)閉變快，結(jié)果穩(wěn)態(tài)Po是降低的。由于蘭尼堿結(jié)合試驗(yàn)測的是穩(wěn)態(tài)Po，測定Po方法的不同（蘭尼堿結(jié)合or單通道電流）或許是某些不一致性的來源。CaMKII在生理作用細(xì)節(jié)上的表現(xiàn)也沒那么讓人省心，單通道研究報道它提高Po的和降低Po的都有，后者還是跟激活性的效果（讓RyR2不能被鎂離子抑制）一同出現(xiàn)的。上升到細(xì)胞層面，對離體心肌的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CaMKII能夠增加舒張期的鈣滲漏而PKA不能，用專門的抑制肽降低它的活性可以讓收縮期SR鈣釋放和舒張期鈣火花都減少。也有人用組成型激活（即一直激活的）的CaMKII做實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這貨反倒抑制RyR2活性，鈣火花、鈣瞬變也都受到了打壓。研究者推測這現(xiàn)象源于某些機(jī)制對CaMKII過分激活的代償，算是防止ECC失穩(wěn)的保險。雖說只是個猜想，它提醒了我們一點(diǎn)，那就是真正的心肌內(nèi)鈣調(diào)控系統(tǒng)是非常復(fù)雜的，有些不一致性說不定就是這種復(fù)雜性的反映。不過再怎么說，大多數(shù)經(jīng)典方式得到的證據(jù)還是支持PKA和CaMKII對RyR2以及ECC整體都有激活性作用，不然兒茶酚胺活化它倆干嗎呢。近來結(jié)構(gòu)生物學(xué)家們也對這倆激酶和RyR2之間的愛恨情仇產(chǎn)生了興趣，并貢獻(xiàn)了不少有趣的研究結(jié)果，比如有人發(fā)現(xiàn)PKA的磷酸化可以讓關(guān)閉的RyR2變構(gòu)為“我準(zhǔn)備好了”的（primed）Po更高的狀態(tài)，再比如關(guān)于CaMKII對S2814的磷酸化能讓PKA對S2808的興趣更強(qiáng)的那檔子事。原文的總結(jié)圖是這樣的，我放到這兒主要是為了讓各位看一下這兩個激酶的真實(shí)樣子（盡管PKA只有一部分）：

? ? 話說到結(jié)構(gòu)研究，我個人覺得最好玩的還真不是這些個跟磷酸化有關(guān)的東西，而是冷凍電鏡和晶體學(xué)研究聯(lián)手貢獻(xiàn)的有關(guān)CaM-RyR2間互作的內(nèi)容。CaM正名鈣調(diào)蛋白，是個萬金油級別的胞內(nèi)鈣感受器，跟鈣但凡有點(diǎn)兒關(guān)系的地方基本都能見到它的身影。很顯然，RyR2跟鈣的關(guān)系之深厚可不能用有點(diǎn)兒來形容，它也好心地在自己身上為CaM的結(jié)合留出了位置，每個亞基不多不少結(jié)合一個。CaM貌如杠鈴，兩頭各有一對能結(jié)合鈣的EF手相，對鈣的親和力還挺高。無論結(jié)沒結(jié)合鈣，CaM都是RyR2超復(fù)合體的常駐組分，它能穩(wěn)定RyR2的關(guān)閉狀態(tài)，結(jié)合鈣時效果最好。有趣的是，手里沒鈣的CaM（接下來稱作apo-CaM）和有鈣在身的CaM（接下來稱作Ca-CaM）跟RyR2互作的方式是不一樣的，這直接導(dǎo)致了它倆對RyR2抑制效果的差異。Apo-CaM的N端與名叫BSolB的結(jié)構(gòu)域結(jié)合，C端結(jié)合在JSol和CSol的交界處，而Ca-CaM的結(jié)合基本只涉及CSol。你可能會說這都是啥結(jié)構(gòu)域啊，上篇那圖里怎么沒有？？？別慌，換了個命名法而已，我換它主要是因?yàn)槲覅⒖嫉奈恼掠玫氖沁@堆名字（……）。這里的BSolB、JSol和CSol分別全稱橋接螺線管B（第一個B是bridging, Sol是solenoid）、連接螺線管（J是junctional）和核心螺線管（C是core）結(jié)構(gòu)域，它們分別對應(yīng)的是之前那圖里的HD1、handle domain和central domain，另外還有個BSolC對應(yīng)HD2。完整一套新命名法及對應(yīng)的3D示意圖我放在下面了，有興趣的可以細(xì)看，沒興趣的可以直接跳到第3張圖看CaM跟RyR2結(jié)合的細(xì)節(jié)。

? ? 話說回來。從上面第2張圖可以看出CSol杵在孔道上方，宛如RyR2體內(nèi)的守門人。得益于這個位置，它能與RyR2的跨膜部分發(fā)生很多相互作用，對通道開閉的控制尤為重要。Ca-CaM直接與CSol互作，誘導(dǎo)其發(fā)生構(gòu)象變化，使之與S6跨膜螺旋的相互作用改變，讓通道傾向于關(guān)閉。Apo-CaM離CSol更遠(yuǎn)，很可能跟它的穩(wěn)定作用更弱有關(guān)。這個互作中有一個有趣的細(xì)節(jié)，雖然已經(jīng)在上一篇里提到過了，但我還是忍不住再說一下。這個細(xì)節(jié)出自一項(xiàng)X射線晶體學(xué)研究，把包含RyR2第三個CaM結(jié)合位點(diǎn)（Ca-CaM結(jié)合于此，另兩個是給apo-CaM的）的蛋白片段和Ca-CaM一起結(jié)晶了。得到的結(jié)構(gòu)顯示，Ca-CaM與RyR2互作時結(jié)合有五個鈣離子，多出來的那個鈣位于“杠鈴”的中間，81號天冬氨酸（D81）和85號谷氨酸（E85）參與了它的結(jié)合。為了檢查這個鈣是不是結(jié)晶時混進(jìn)來的沒有生理學(xué)意義的東西，研究者把E85突變?yōu)閭?cè)鏈不帶電的丙氨酸，發(fā)現(xiàn)突變的CaM在無法結(jié)合第五個鈣的同時，與RyR2的結(jié)合也減弱，說明這個鈣可能真的有用。

? ? 總之，無論出自費(fèi)心的功能研究還是養(yǎng)眼的結(jié)構(gòu)研究，已有越來越多的證據(jù)表明CaM是一個重要的RyR2穩(wěn)定因子，某種意義上算是FKBP12.6的同行，但說實(shí)話有關(guān)它研究的一致性可比這位同行高太多了。FKBP12.6的異常解離被認(rèn)為在許多獲得性或先天性的病理過程中起著作用，最近這個說法被推廣到了CaM身上，而且有不錯的證據(jù)作為支撐。至此，我們已經(jīng)把在學(xué)界最引人注目的胞質(zhì)側(cè)調(diào)控機(jī)制聊了個遍。讓我們稍事休息，然后啟程前往SR內(nèi)，拜見我自己期待已久的“SR四天王”——集鈣蛋白2（Casq2）、富含組氨酸的鈣結(jié)合蛋白（HRC）、三聯(lián)蛋白（triadin）與交界蛋白（junctin）。它們間及它們與RyR2間的關(guān)系復(fù)雜到催人淚下，根本沒法分開講，所以我打算從我最喜歡的Casq2開始，由它帶出它自己與另三個小伙伴的復(fù)雜故事。

? ? Casq家有兩位已知成員，大哥Casq1在骨骼肌與RyR家老大為伴，小弟Casq2則在心肌陪著RyR家老二，編號恰巧兩兩對得上。Casq2是個糖蛋白，切完19氨基酸的信號肽后全長380個氨基酸。它很對得起“收集鈣的蛋白”這個名字，承包了心肌SR大部分鈣緩沖工作，含量比HRC或鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin）等同行多得多。它對鈣親和力不高，但它有容乃大，一分子就能結(jié)合40~50個鈣。這正是一個緩沖劑的基本素養(yǎng)：周圍鈣多時就將其結(jié)合在自己身上，周圍鈣少時就將結(jié)合的鈣迅速釋放出來。每次鈣瞬變期間SR只釋放35~40%的鈣而不會被榨干，主要也是Casq2的功勞。它結(jié)合這么多鈣靠的不是什么基序，而是大量帶負(fù)電荷的氨基酸。接近些觀察的話，你會發(fā)現(xiàn)這家伙與鈣的關(guān)系不是一般地緊密。如果周圍一丁點(diǎn)鈣都沒有，Casq2是沒法折疊成型的，只能是一團(tuán)亂糟糟的肽鏈。周圍鈣濃度逐漸上升時，它會先部分折疊進(jìn)入熔球（molten globule）態(tài)，再在鈣的誘導(dǎo)下完全折疊，變成三葉草的形狀。故事到此并沒有結(jié)束：如果繼續(xù)增加鈣，Casq2會先面對面（指通過N端相互作用）地形成二聚體，然后二聚體背靠背（指通過C端相互作用）地兩兩形成四聚體乃至更多聚體，最終產(chǎn)物是纖維狀的N聚體。單體們互相結(jié)合的方式使多聚體內(nèi)部存在一條與外部溶液相通的通道，鈣可以結(jié)合在里面；單體與單體的結(jié)合處會形成帶負(fù)電的口袋，鈣照樣能鉆進(jìn)去；而就算只看單體，折疊成型的單體內(nèi)部各結(jié)構(gòu)域的交界處也容納有鈣離子，它們起到了將各結(jié)構(gòu)域組織在一起的橋梁作用。結(jié)果，抱團(tuán)的Casq2平均每分子的緩沖能力強(qiáng)于單體，而折疊好了的單體的緩沖能力又強(qiáng)于不完全折疊的單體，可以用“結(jié)合越多鈣，越能結(jié)合鈣”來形容。這一連串變構(gòu)相當(dāng)奇妙，也是讓我不可自拔地喜歡上Casq2的誘因之一。工作心肌中，Casq2在交界區(qū)SR富集，是單體、二聚體和多聚體的混合物。它的存在形式隨鈣濃度的變化而變化，除了被動地反映局部鈣濃度之外，還主動地影響著其他蛋白們的活動。這些蛋白中自然包括RyR2。

? ? 作為鈣緩沖劑的扛把子，Casq2調(diào)控RyR2的最直觀方式可能非緩沖鈣離子莫屬。這有什么用呢？最容易想到的可能是，鈣緩沖劑的存在能使SR輕松地儲存巨量鈣：若SR容積不變而鈣緩沖劑減少，則由于SERCA2a力量有限，SR的儲鈣量將降低。Casq2過表達(dá)的心肌SR儲鈣量顯著增加，也側(cè)面印證了這一點(diǎn)。另一方面，由于代償機(jī)制的存在，就算Casq2沒了，SR儲鈣量也真不一定有多大變化。但代償機(jī)制不可能完全替代Casq2的功能，所以Casq2完蛋后，SR的鈣緩沖能力肯定降低。有點(diǎn)像缺少緩沖劑的溶液pH值對酸或堿的加入十分敏感，鈣緩沖能力的下降將使SR內(nèi)游離鈣濃度的震蕩更加猛烈，主要體現(xiàn)在舒張期SR裝載時游離鈣濃度上升速度顯著加快。要知道RyR2是要感知SR內(nèi)鈣的，這些翻江倒海的鈣會讓它神經(jīng)過敏，一個不小心就SOICR（鈣庫超載誘導(dǎo)的鈣釋放）了。此中細(xì)節(jié)我們未來再說，之所以在此先提及，是因?yàn)槲矣X得思考鈣緩沖缺陷的后果對理解鈣緩沖的作用有很大的幫助。（遺傳學(xué)傳統(tǒng)藝能：認(rèn)識一樣?xùn)|西最快的方法就是看看把這東西搞砸的后果。）

? ??緩沖無疑是Casq2工作中的重要方面，不過正如我劇透過的那樣，鈣緩沖蛋白的作用可不止緩沖鈣離子。作為RyR2的好基友，Casq2的兼職就是以相對直接的方式調(diào)控RyR2，整體來說起抑制性作用。它可能具有兩種調(diào)節(jié)RyR2的方式，一種是通過與RyR2直接互作來調(diào)控RyR2，另一種則是通過與其他RyR2結(jié)合蛋白互作間接調(diào)控RyR2。直接互作的最早證據(jù)來自對Casq1研究結(jié)果的外推，直到近年才有人確定了Casq2應(yīng)該是能直接結(jié)合RyR2的，通過C末端小尾巴與RyR2跨膜部分的第一個SR腔內(nèi)環(huán)相互作用。至于間接作用么，這就說來話長了，畢竟它牽扯到其他的調(diào)控因子?？雌饋砣?lián)蛋白和交界蛋白出場的時候到了。

? ? 先說一點(diǎn)，這倆貨都沒有標(biāo)準(zhǔn)譯名，我習(xí)慣用英文名稱呼它倆（之前的文章也是），但今后我打算在本系列里使用我隨便翻譯的這倆名字。它們是外貌相似的單次跨膜蛋白，C端的長尾巴伸入SR腔內(nèi)，C端尾巴和N端尾巴都可以與RyR2互作。三聯(lián)蛋白和交界蛋白的名字都與肌肉有關(guān)，分別取自骨骼肌的三聯(lián)管和交界區(qū)SR的“交界”，這暗示著它們廣泛分布于肌肉中，骨骼肌與心肌都有。此處插播一件趣聞，那就是交界蛋白的基因名聽起來與它沒有半毛錢關(guān)系，叫ASPH。這樁怪事起因于可變剪接：ASPH mRNA有幾個剪接變體翻譯出來的東東有天冬氨酸β-羥化酶（aspartate?β-hydroxylase,?縮寫ASPH）活性，另一些沒有，而交界蛋白屬于后者。三聯(lián)蛋白的基因名TRDN還算比較科學(xué)，它也因可變剪接而存在不同的亞型，心肌的亞型主要是三聯(lián)蛋白-1。目前已發(fā)現(xiàn)剪接因子SRp38參與調(diào)控TRDN轉(zhuǎn)錄物的可變剪接。這個因子是一張龐大調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分，與諸如肌膜相關(guān)蛋白（一類尾部錨定的膜蛋白）、早期生長應(yīng)答-1（是個轉(zhuǎn)錄因子）之類的其他成員一起一絲不茍地組織著內(nèi)鈣調(diào)控蛋白們的共表達(dá)。內(nèi)鈣調(diào)控蛋白們的表達(dá)如此井井有條、恰到好處，要感謝它們的貢獻(xiàn)；而內(nèi)鈣調(diào)控蛋白們各自的功能“剪不斷、理還亂”，也得拜它們所賜。

? ? 言歸正傳。三聯(lián)&交界蛋白的一大愛好便是勾搭RyR2和Casq2，后者常被叫做“把Casq2錨定在RyR2上”，可能對將Casq2定位在交界區(qū)SR有作用。這倆用來勾搭Casq2的是C端尾巴上的若干KEKE基序，因富含賴氨酸（K）和谷氨酸（E）而得名。憑借著它，三聯(lián)&交界蛋白能結(jié)合Casq2，能結(jié)合RyR2，還能結(jié)合HRC——SR四天王忽然齊了。Casq2的結(jié)合與鈣濃度相關(guān)，鈣極少時沒法結(jié)合（沒折疊好怎么結(jié)合），鈣濃度超過5mM后也會逐漸解離。當(dāng)然嘍，只確定哪些蛋白在互作還不夠，重要的是它們的互作有什么用。先說交界蛋白吧，一項(xiàng)單通道研究發(fā)現(xiàn)在胞質(zhì)側(cè)加入它的N端片段可使RyR2活性提高5倍，在SR腔側(cè)加入C端片段使RyR2活性降低50%，完整蛋白則令RyR2的活性提高3倍，整體表現(xiàn)為激活。對離體心肌的研究則發(fā)現(xiàn)，SR內(nèi)鈣濃度低時（＜1mM）交界蛋白的缺失抑制SR鈣釋放，SR內(nèi)鈣濃度高時（比如β受體活化后）它的缺失則激活RyR2，增加舒張期鈣釋放。敲除交界蛋白的心肌平時SR鈣庫存更多、舒張期鈣滲漏更少，鈣火花更少但更亮（釋放的鈣多），β受體活化后鈣火花頻率和鈣瞬變振幅的增幅更明顯，舒張期鈣滲漏反而更顯著，很容易讓人聯(lián)想到“又激活又抑制”的效果。考慮到交界蛋白滾掉后還有三聯(lián)蛋白、Casq2等調(diào)控因子，很難說上述的雙面作用就反映了交界蛋白或交界蛋白-Casq2復(fù)合體自己的性質(zhì)，不過巧的是它和那項(xiàng)單通道研究都觀察到了交界蛋白對RyR2的激活效應(yīng)。同樣的激活效應(yīng)也出現(xiàn)在了三聯(lián)蛋白與RyR2的互作中，證據(jù)主要來自單通道實(shí)驗(yàn)和過表達(dá)模型（但也有爭議）。有趣的是，單通道實(shí)驗(yàn)里Casq2與它倆的結(jié)合可以解除這種激活效應(yīng)?；谶@些結(jié)果，最早的對于這仨作用的猜想認(rèn)為三聯(lián)&交界蛋白對RyR2具有激活作用，Casq2與之結(jié)合后激活效果解除，仿若一個三元鈣感受器，借Casq2的來去感知鈣濃度的信息，實(shí)時調(diào)控RyR2的活性。這個猜想聽來很棒，然而更多研究顯示三聯(lián)&交界蛋白的作用比想象中復(fù)雜得多，尤其是它倆中的前者。事實(shí)上，越來越多的證據(jù)支持三聯(lián)蛋白與交界蛋白具有不同的主要功能：交界蛋白以較為直接的方式調(diào)節(jié)RyR2的活性，盡管人們對它的具體生理作用所知甚少；而三聯(lián)蛋白則主要參與二聯(lián)間隙微結(jié)構(gòu)的維持，以及組織其他鈣調(diào)控蛋白們的表達(dá)。這就把我們帶回到了上一段末尾。

? ? 如前所述，相當(dāng)一部分心肌內(nèi)鈣調(diào)控蛋白各自的表達(dá)環(huán)環(huán)相扣，類似于牽一發(fā)而動全身的情況并不少見。比方說，三聯(lián)蛋白敲除之后，RyR2、Casq2、交界蛋白、親交界蛋白（junctophilin, JPH）-1和-2的表達(dá)水平分別下降了50%、60%、92%和30~40%（倆JPH一塊兒算），而不處于交界區(qū)SR的蛋白，像SERCA2a、PLN、LTCC和NCX等則沒什么變化。Casq2不但含量下降，而且難以正確地定位到交界區(qū)SR，結(jié)果會有大量Casq2迷失在縱行SR內(nèi)，真是禍不單行。上邊的生面孔JPH是個結(jié)構(gòu)蛋白，N端借與磷脂結(jié)合錨定在T管質(zhì)膜上，C端以疏水α螺旋插入交界區(qū)SR膜，像柔韌牢固的纜繩一樣把二者聯(lián)系在一起，對二聯(lián)間隙結(jié)構(gòu)的維持至關(guān)重要。三聯(lián)蛋白缺失后二聯(lián)間隙結(jié)構(gòu)翻天覆地的變化，或許就與JPH表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。怎么個翻天覆地呢？瞧瞧：沒了三聯(lián)蛋白，心肌中交界區(qū)SR膜與T管膜在空間上的緊密聯(lián)系頓時少了50%——能形成二聯(lián)間隙的空間一下子少了一半！這使約50%的LTCC找不到RyR2作伴，無法得到來自RyR2的鈣對它們的負(fù)反饋抑制，結(jié)果內(nèi)向鈣電流增強(qiáng)，SR鈣儲量增大（輸入多了）。同時，大把大把的RyR2也找不著LTCC，對它們而言內(nèi)向鈣電流再強(qiáng)也沒用，結(jié)果就出現(xiàn)了SR鈣儲量上升、CICR卻受抑制的矛盾一幕。篇幅所限，我對三聯(lián)蛋白敲除后果的描述到此為止，不過這已經(jīng)足以說明三聯(lián)蛋白與二聯(lián)間隙結(jié)構(gòu)維持的關(guān)系。另一邊，交界蛋白的敲除對其他交界區(qū)SR蛋白沒什么影響，這再次暗示了它倆在功能上的差異，以及在那張我想象中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中位置的不同。

? ??說到這里，本文準(zhǔn)備談到的所有蛋白中只剩HRC沒有正經(jīng)露一手了。它在學(xué)界的地位一直有點(diǎn)尷尬，我猜主要是因?yàn)檎冀^對數(shù)量優(yōu)勢且與遺傳病明確相關(guān)的Casq2搶光了鈣緩沖蛋白的風(fēng)頭。很多研究RyR2的人都不特別關(guān)注HRC，但我認(rèn)為它的作用應(yīng)該受到重視。剛巧它能與三聯(lián)蛋白互作，我就把它放在了SR四天王的組合里面，讓它出出風(fēng)頭。像Casq2一樣，HRC靠帶負(fù)電的表面結(jié)合鈣離子（它還能結(jié)合鋅離子，這點(diǎn)Casq2辦不到），會因鈣的結(jié)合而發(fā)生構(gòu)象變化及寡聚化、多聚化。正常SR內(nèi)鈣濃度下，它似乎主要是多聚體，不過鈣濃度極高時它反倒變成單體。現(xiàn)在學(xué)界對HRC與RyR2功能之間的關(guān)系研究較少，其中我覺得最好玩的研究之前已經(jīng)講過了。如果你忘了的話，它大概是這樣的：有人在敲除Casq2的基礎(chǔ)上再敲除HRC，猜測由此而來SR內(nèi)鈣緩沖功能的進(jìn)一步惡化會把心肌禍禍得比只敲Casq2更慘，誰知結(jié)果跟他們的預(yù)測背道而馳。他們提出的新猜想是：Casq2對RyR2有抑制作用，HRC對RyR2有激活作用，所以兩個都無了（不太穩(wěn)定的新平衡）比少一個（失衡）要好。HRC是否能與RyR2直接互作仍有爭議，但它與三聯(lián)蛋白的互作幾乎毋庸置疑。這個互作的強(qiáng)度也與鈣濃度有關(guān)，它在鈣濃度較為中庸時最強(qiáng)，鈣更多或更少時則被削弱。有趣的是，HRC也能跟SERCA2a互作，這一互作在鈣濃度很低時最強(qiáng)，隨著鈣濃度升高單調(diào)遞減，對SERCA2a似乎起抑制作用。我好像能想象出HRC隨著SR內(nèi)局部鈣濃度的變化在RyR2和SERCA2a兩邊跑的樣子了。鑒于現(xiàn)在對HRC與RyR2之間關(guān)系的研究實(shí)在不多，而且這次聊天的時間已經(jīng)夠長了，有關(guān)HRC的事兒就先聊到這。要是你覺得不夠盡興的話，別著急，回頭或許我們還能見到它。

? ? 本次閑聊已經(jīng)接近尾聲，然而本系列對RyR2調(diào)控的探究實(shí)際上才剛剛開始。畢竟RyR2調(diào)控實(shí)在是個宏大而又復(fù)雜的領(lǐng)域，隨便從上文挑一個蛋白都夠?qū)懮虾脦灼科獛兹f字的綜述，不消說你也猜得出本文因篇幅限制略去了不知多少有趣的東西。比如說，F(xiàn)KBP12對RyR2有什么用？到底什么叫“高磷酸化”？為什么SR內(nèi)鈣緩沖能力下降就容易發(fā)生SOICR？Casq2會不會也像三聯(lián)蛋白那樣參與交界區(qū)SR蛋白表達(dá)的調(diào)控或二聯(lián)間隙結(jié)構(gòu)的維持？試圖回答如此難題的人們往往不能局限于對正常情況的研究，而得通過研究異常狀況獲得對正常功能的見解。今后閑聊的主題將從生理學(xué)轉(zhuǎn)向病理生理學(xué)，這方面的研究成果除了能幫我們更好地了解生理狀態(tài)下的RyR2調(diào)控之外，還對醫(yī)療研究頗有助益。我們將遇見的第一個病理生理學(xué)情境是臭名昭著的心力衰竭?？紤]到鈣對心肌的舒縮無比重要，RyR2的異常與心衰相關(guān)聽起來一點(diǎn)都不令人驚奇，不過與此相關(guān)的研究成果卻總是充滿驚喜。做好準(zhǔn)備嘍，我們下回見。

? ? 沒法詳細(xì)列出的資料來源包括維基百科以及GenBank、GeneCard、UniProt、HGNC等數(shù)據(jù)庫。本文中出現(xiàn)的3個RyR2磷酸化位點(diǎn)的標(biāo)號在不同物種的RyR2中不同，此處按我的習(xí)慣使用的是人RyR2的編號。我最開始本來沒打算費(fèi)工夫去查的，沒想到文獻(xiàn)里用得相當(dāng)隨意，幾篇看下來我自己都搞不清哪個是哪個了，只好去PhosphoSite確認(rèn)了一下。（后來本著不怕一萬就怕萬一的精神，我又去UniProt對著人RyR2的序列數(shù)了一下，確認(rèn)那三個位號的氨基酸都是絲氨酸后才徹底放心。）

參考文獻(xiàn)&拓展閱讀：

Blayney, LM., and Lai, FA. Ryanodine receptor-mediated arrhythmias and sudden cardiac death. Pharmacol Ther 123, 151-177 (2009). DOI: 10.1016/j.pharmthera.2009.03.006

備注：享有置頂待遇的本系列常駐嘉賓。

Wleklinski, MJ., Kannankeril, PJ., and Knollmann, BC. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. J Physiol 598, 2817-2834 (2020). DOI:?10.1113/JP276757

備注：封面圖出處，畫風(fēng)我很喜歡。

Yano, M., Yamamoto, T., Kobayashi, S., and Matsuzaki, M. Role of ryanodine receptor as a Ca2+ regulatory center in normal and failing hearts. J Cardiol 53, 1-7 (2009). DOI: 10.1016/j.jjcc.2008.10.008

備注：頭圖出處。

Gonano, LA., and Jones, PP. FK506-binding proteins 12 and 12.6 (FKBPs) as regulators of cardiac ryanodine receptors: Insights from new functional and structural knowledge. Channels 11, 415-425 (2017). DOI: 10.1080/19336950.2017.1344799

備注：相當(dāng)一部分有關(guān)FKBP的內(nèi)容以及那張F(tuán)KBP與RyR2結(jié)合的圖的出處。

Guo, T., Cornea, RL., Huke, S., Camors, E., Yang, Y., Picht, E., Fruen, BR., and Bers, DM. Kinetics of FKBP12.6 Binding to Ryanodine Receptors in Permeabilized Cardiac Myocytes and Effects on Ca Sparks. Circ Res 106, 1743-1752 (2010). DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.110.219816

備注：對于FKBP12和12.6與RyR2結(jié)合狀況的研究。這里邊發(fā)現(xiàn)平時只有10~20%RyR2與FKBP12.6結(jié)合（因?yàn)樗伲珟缀跛蠪KBP12.6都是與RyR2結(jié)合的（因?yàn)橛H和力高），不過只有FKBP12.6能抑制RyR2的基礎(chǔ)活性（就是沒有兒茶酚胺之類的刺激它時的活性）。

Gellen, B., Fernández-Velasco, M., Briec, F., Vinet, L., LeQuang, K., Rouet-Benzineb, P., Bénitah, JP., Pezet, M., Palais, G., Pellegrin, N., Zhang, A., Perrier, R., Escoubet, B., Marniquet, X., Richard, S., Jaisser, F., Gómez, AM., Charpentier, F., and Mercadier, JJ. Conditional FKBP12.6 Overexpression in Mouse Cardiac Myocytes Prevents Triggered Ventricular Tachycardia Through Specific Alterations in Excitation- Contraction Coupling. Circulation 117, 1778-1786 (2008). DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.107.731893

備注：FKBP12.6條件過表達(dá)（只在心肌過表達(dá)）研究的出處。

Miotto, MC., Weninger, G., Dridi, H., Yuan, Q., Liu, Y., Wronska, A., Melville, Z., Sittenfeld, L., Reiken, S., and Marks, AR. Structural analyses of human ryanodine receptor type 2 channels reveal the mechanisms for sudden cardiac death and treatment. Sci Adv 8, eabo1272 (2022). DOI: 10.1126/sciadv.abo1272

備注：PKA對RyR2作用的結(jié)構(gòu)研究，話說這篇里邊那張總結(jié)性的圖（Figure6）挺好看的。

Haji-Ghassemi, O., Yuchi, Z., and Van Petegem, F.?The Cardiac Ryanodine Receptor Phosphorylation Hotspot Embraces PKA in a Phosphorylation-Dependent Manner. Mol Cell 75, 39-52 (2019). DOI:?10.1016/j.molcel.2019.04.019

備注：有關(guān)于CaMKII磷酸化S2814能促進(jìn)PKA磷酸化S2808的那篇研究，以及相關(guān)圖片出處。

Fowler, ED., and Zissimopoulos, S. Molecular, Subcellular, and Arrhythmogenic Mechanisms in Genetic RyR2 Disease. Biomolecules 12, 1030 (2022). DOI:?10.3390/biom12081030

備注：新命名法、新命名法那兩張圖及部分CaM相關(guān)內(nèi)容的出處。對了，這篇綜述比較短但很有意思，內(nèi)容相當(dāng)全面（盡管沒涉及那么多細(xì)節(jié)），推薦一讀。

Ogawa, H., Kurebayashi, N., Yamazawa, T., and Murayama, T.?Regulatory mechanisms of ryanodine receptor/Ca2+ release channel revealed by recent advancements in structural studies. J Muscle Res Cell M 42, 291-304 (2021). DOI:?10.1007/s10974-020-09575-6

備注：CaM結(jié)合前后位移那張圖的出處。

Yu Q., Anderson, DE., Kaur, R., Fisher, AJ., and Ames, JB.?The Crystal Structure of Calmodulin Bound to the Cardiac Ryanodine Receptor (RyR2) at Residues Phe4246–Val4271 Reveals a Fifth Calcium Binding Site. Biochemistry 60, 1088-1096 (2021). DOI: 10.1021/acs.biochem.1c00152

備注：有關(guān)于CaM第5個鈣結(jié)合位點(diǎn)的所有內(nèi)容（包括那張圖）的出處。話說上一篇也提到了這個內(nèi)容，然而我忘記在上一篇里引用它了……

Wang, Q., Paskevicius, T., Filbert, A., Qin, W., Kim, HJ., Chen, XZ., Tang, J., Dacks, JB., Agellon, LB., and Michalak, M.?Phylogenetic and biochemical analysis of calsequestrin structure and association of its variants with cardiac disorders. Sci Rep 10, 18115 (2020). DOI:?10.1038/s41598-020-75097-3

備注：Casq在進(jìn)化樹上不同物種中分布那張圖的出處。我每次看到這張圖都有把它打出來貼在我床頭或其他什么地方的墻上當(dāng)海報的沖動。（到底是因?yàn)閷?shí)在喜歡Casq2??！(?≧?≦)? 它應(yīng)該是我第二喜歡的蛋白了，第一喜歡的當(dāng)然是RyR2~）

Faggioni, M., and Knollmann, BC. Calsequestrin 2 and arrhythmias. Am J Physiol Heart Circ Physiol 302, H1250-H1260 (2012). DOI:?10.1152/ajpheart.00779.2011

Sibbles, ET., Waddell, HMM., Mereacre, V., Jones, PP., Munro, ML.?The function and regulation of calsequestrin-2: implications in calcium-mediated arrhythmias. Biophys Rev 14, 329-352 (2022). DOI:?10.1007/s12551-021-00914-6

備注：有關(guān)Casq2的大部分內(nèi)容的出處，第二篇也是那幅《Casq2變形記》關(guān)于Casq2構(gòu)象變化的圖的出處。話說這兩篇文章剛好隔了10年……

Titus, EW., Deiter, FH., Shi, C., Wojciak, J., Scheinman, M., Jura, N., and Deo, RC.?The structure of a calsequestrin filament reveals mechanisms of familial arrhythmia.?Nat Struct Mol Biol 27, 1142–1151 (2020). DOI:?10.1038/s41594-020-0510-9

備注：Casq多聚體結(jié)構(gòu)那張圖的出處。

Chopra, N., and Knollmann, BC. Triadin regulates cardiac muscle couplon structure and microdomain Ca2+ signalling: a path towards ventricular arrhythmias. Cardiovasc Res 98, 187-191 (2013). DOI:?10.1093/cvr/cvt023

Dulhunty, A., Wei, L., and Beard, N. Junctin - the quiet achiever. J Physiol 587, 3135-3137 (2009). DOI:?10.1113/jphysiol.2009.171959

備注：有關(guān)三聯(lián)蛋白和交界蛋白的大部分內(nèi)容的出處，第一篇文章也是三聯(lián)蛋白敲除前后二聯(lián)間隙結(jié)構(gòu)變化那張圖的出處。由于它們之間那復(fù)雜的關(guān)系，名字里講三聯(lián)蛋白的第一篇也講到了交界蛋白，第二篇則也講到了三聯(lián)蛋白。

Li, L., Mirza, S., Richardson, SJ., Gallant, EM., Thekkedam, C., Pace, SM., Zorzato, F., Liu, D., Beard, NA., Dulhunty, AF.?A new cytoplasmic interaction between junctin and ryanodine receptor Ca2+ release channels.?J Cell Sci 128, 951-963 (2015). DOI:?10.1242/jcs.160689

備注：交界蛋白的N、C端片段及完整蛋白與RyR2互作的單通道研究具體數(shù)據(jù)出處。

Arvanitis, DA., Vafiadaki, E., Sanoudou, D., and Kranias, EG.?Histidine-rich calcium binding protein: The new regulator of sarcoplasmic reticulum calcium cycling. J Mol Cell Cardiol 50, 43-49 (2011). DOI:?10.1016/j.yjmcc.2010.08.021

備注：與HRC相關(guān)的大部分內(nèi)容的出處。

? ? 好了，我要去繼續(xù)啃有關(guān)于RyR2和心力衰竭的文獻(xiàn)了……不知道什么時候再見嘍_(:з」∠)_