文中藏有質(zhì)粒小提SOP，

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質(zhì)粒

質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。

質(zhì)粒抽提

從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。采用強(qiáng)堿液、加熱或溶菌酶（主要針對革蘭氏陽性細(xì)菌）可以破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基磺酸鈉（SDS）和 TritonX-100（一般很少使用）可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或 Triton X-100處理后， 細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNA變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circular　DNA，簡稱cccDNA）的兩條鏈不會(huì)相互分開。當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。

質(zhì)粒抽提最常用的方法是堿裂解法，它具有得率高、適用面廣、快速和純度高等特點(diǎn)。當(dāng)然，堿裂解法也有缺陷：容易導(dǎo)致不可逆的變性。要降低不可逆的變性，就要控制好堿裂解的時(shí)間。

堿裂解法抽提質(zhì)粒需要用到以下三種溶液

溶液Ⅰ

50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 壓力下蒸汽滅菌15 min，4℃保存。

溶液Ⅱ?

?0.2 mmol/L NaOH（從10 mmol/L 貯存液中現(xiàn)用現(xiàn)稀釋），10 g/L SDS（室溫保存）。

溶液Ⅲ

5 mol/L乙酸鉀 60.0 mL，冰乙酸 11.5 mL，無菌水28.5 mL，?4℃保存，使用時(shí)置于冰浴中。??

下面介紹一下堿裂解法小提質(zhì)粒

的具體操作：

01

柱平衡：向吸附柱中加入500 μl平衡Buffer，12000 rpm離心30-60 s，倒掉收集管中的廢液；

注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基質(zhì)膜，提高質(zhì)粒的得率；吸附柱平衡后應(yīng)立即使用，長時(shí)間放置會(huì)影響其吸附效果。

02

收菌：將過夜培養(yǎng)的菌液用8000 g，2-3 min低溫離心，吸棄液體培養(yǎng)基；

注意：高拷貝的質(zhì)粒，需要5-15 mL的培養(yǎng)菌液；低拷貝的質(zhì)粒，則需要15-30 mL的培養(yǎng)菌液；殘留的液體培養(yǎng)基過多會(huì)影響細(xì)菌的裂解效果，應(yīng)盡可能吸干培養(yǎng)基。

03

向離心管中加入250 μl 溶液Ⅰ（加入RNase A），吹勻菌沉淀并將懸液轉(zhuǎn)移至新1.5 mL EP管中；

注意：菌體懸浮不完全會(huì)導(dǎo)致裂解不完全，質(zhì)粒提取量和純度會(huì)降低。

04

向EP管中加入250 μl 溶液Ⅱ（裂解Buffer），溫和翻轉(zhuǎn)EP管6-10次，使菌體充分裂解，液體變得澄清濃稠（開蓋拉絲）；

注意：所用時(shí)間不宜超過5 min，以免質(zhì)粒被破壞；切勿劇烈震蕩；液體未變得澄清，則表明裂解不充分，可適當(dāng)減少菌體量或增大Buffer使用量；若溶液Ⅱ出現(xiàn)渾濁，可37 ℃水浴幾分鐘，待液體恢復(fù)澄清即可使用。

05

向EP管中加入350 μl 溶液Ⅲ，溫和翻轉(zhuǎn)EP管6-10次，此時(shí)可觀察到管內(nèi)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000 rpm室溫離心10 min；

注意：若上清中仍有少量白色絮狀物，可再次離心2-3 min直至液體澄清。

06

將離心后上清轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000 rpm離心30-60 s，倒掉收集管中的廢液；

07

可選：向吸附柱中加入500 μl Buffer PD（富含蛋白酶），12000 rpm離心1 min，倒掉收集管中的廢液；

注意：此步對富含內(nèi)源核酸酶的宿主菌（endA+）是必須的，對于endA-宿主菌可省略。

08

向吸附柱中加入600 μl Wash Buffer（加入無水乙醇），12000 rpm離心1 min，倒掉收集管中的廢液；

09

重復(fù)步驟8一次；

10

將吸附柱和收集管放回離心機(jī)中，12000 rpm空轉(zhuǎn)離心2 min；

注意：此步驟非常關(guān)鍵，乙醇是否去除干凈會(huì)影響后續(xù)的洗脫效率以及PCR等效果。

11

將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中，拿到超凈工作臺(tái)中開蓋鼓風(fēng)吹5-10 min；

12

向吸附柱膜的中央滴加40-50 μl預(yù)熱Elution Buffer或者DD水，關(guān)蓋靜置3-5 min，12000 rpm離心2 min；

注意：洗脫Buffer預(yù)熱后效果更好；可以根據(jù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)、宿主菌等因素調(diào)整洗脫Buffer的添加量。

13

離心后將EP管內(nèi)的液體重新滴加至吸附柱膜上，12000 rpm離心1 min；

14

做好標(biāo)記，取2 μl質(zhì)粒跑1%瓊脂糖凝膠電泳檢測驗(yàn)證；

15

提取出的質(zhì)粒-20℃保存。

抽提質(zhì)粒中的常見問題

1?提不出質(zhì)?；蛘哔|(zhì)粒提取量很少

(1) 菌體中無質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

(2) 質(zhì)?？截悢?shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。

(3) 菌種老化：若是甘油保藏菌，需要在活化后再培養(yǎng)搖菌；建議涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。

(4) 吸附柱過載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或者2×YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)?；蛩拗骶欠浅８叩目截悢?shù)或生長率，則需調(diào)整LB培養(yǎng)液體積。

(5) 堿裂解不充分：使用過多的菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的用量。對低拷貝數(shù)質(zhì)粒提取時(shí)，可加倍使用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，有助于增加質(zhì)粒提取量和質(zhì)粒質(zhì)量。

(6) 溶液使用不當(dāng)：溶液Ⅱ和Ⅲ在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37 ℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。

(7) 洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位，以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠。膜的表面，達(dá)到最大洗脫效率。

(8) 洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，pH洗脫效率取決于pH值。最大洗脫效率在pH 7.0-8.5之間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫緩沖液加熱至60℃后使用有利于提高洗脫效率。

(9) 洗脫體積太小：洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

(10) 洗脫時(shí)間過短：洗脫時(shí)間對回收率也會(huì)有一定的影響。洗脫時(shí)放置1 min可達(dá)到較好的效果。

(11) 乙醇?xì)埩?/strong>：漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗后應(yīng)晾干樹脂，再加入洗脫緩沖液。

(12) 質(zhì)粒未全部溶解：洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長溶解時(shí)間。

2?質(zhì)粒純度不高

(1) 混有蛋白質(zhì)：不要過多使用菌體。溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ處理并離心后，溶液應(yīng)為澄清的，如果還混有微小蛋白質(zhì)懸浮物，可再次離心去除后再進(jìn)行下一步驟。

(2) 混有RNA：RNase A處理不徹底，請減少菌體用量或加入溶液Ⅲ后室溫放置一段時(shí)間。如果溶液Ⅰ已保存6個(gè)月以上，要及時(shí)向Ⅰ中添加RNase A。

(3) 混有基因組DNA：加入溶液Ⅱ、Ⅲ后應(yīng)溫和混勻，若劇烈震蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片混在質(zhì)粒中。如果加入溶液Ⅱ后過于黏稠，無法溫和混勻，請減少菌體用量。細(xì)菌培養(yǎng)不要超過16 h，時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解。

(4)溶液Ⅲ加入時(shí)間過長：溶液Ⅲ加入后，放置時(shí)間不要太長，否則有可能產(chǎn)生小片段DNA污染。

(5) 宿主菌含大量核酸酶：宿主菌含大量核酸酶，在質(zhì)粒提取中降解質(zhì)粒DNA，影響提取質(zhì)粒DNA的完整性，最好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，例如DH5α和TOP10。

(6) 裂解時(shí)間過長：加入溶液Ⅱ后裂解時(shí)間不宜超過5 min。

(7) 質(zhì)粒的二聚體和多聚體形式：是質(zhì)粒復(fù)制過程中形成的，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢測出。