一、原理&應(yīng)用

一）PCR

二）qPCR——化學(xué)原理

1.SYBR Green

注：具有結(jié)合雙鏈小溝的結(jié)構(gòu)特性，體系中有非特異性擴(kuò)增時(shí)也是可以結(jié)合的，所以要保證產(chǎn)物是特異性的

2.TaqMan Probe

TaqMan Probe：20nt（堿基）的寡聚核苷酸，兩端有5-發(fā)光基團(tuán)，3-淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)二者距離近不發(fā)光。dna外切酶可水解探針，距離變遠(yuǎn)發(fā)光。

注：探針的退火溫度要比引物高5-8度。原因：退火時(shí)要讓探針比引物先結(jié)合到模板上，才能被外切酶水解

3.SYBR 對(duì)比 TaqMan Probe

三）qPCR——數(shù)學(xué)原理

no：初始模板量，n：循環(huán)次數(shù)，N：終產(chǎn)物數(shù)量，e：擴(kuò)增效率；Ct：循環(huán)數(shù)；k/b：常數(shù)

注：實(shí)驗(yàn)過程有消耗，實(shí)際方程為紅色那個(gè)

計(jì)數(shù)方法：儀器給出CT值，帶入線性方程計(jì)算初始濃度N0

四）應(yīng)用

二、流程&注意事項(xiàng)

一）流程

1.RNA提取

1）RNA

RNA易降解原因：（1）單鏈（2）核糖核酸上的羥基（3）RNAase存在于周圍環(huán)境，反應(yīng)劇烈

提取原理：（1）盡量不要使RNA降解

2）流程

圖：動(dòng)物細(xì)胞/動(dòng)物組織/植物細(xì)胞/血液

• 動(dòng)物組織更推薦液氮研磨，勻漿會(huì)溫度升高/遇到內(nèi)外源性RNAase
• 植物組織有細(xì)胞壁更推薦液氮研磨
• 細(xì)胞樣品簡(jiǎn)單只需得到細(xì)胞沉淀

β-巰基乙醇可變性蛋白釋放核酸

Trizol法——沉淀法（傳統(tǒng)經(jīng)典）

胍鹽——過柱法

完整RNA三條帶：20、88、5，第一條帶亮度是第二條的兩倍，第三條最淺

中間圖條帶二最亮——表明RNA部分降解

右邊圖條帶三最亮——表明RNA嚴(yán)重降解，需重新提取RNA

提取關(guān)鍵點(diǎn)

2.逆轉(zhuǎn)錄

1）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

此過程會(huì)加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、BUffer

2）逆轉(zhuǎn)錄酶

兩種常用酶：M-MLV/AMV均具有RNAase的活性，降低cDNA的完整性，當(dāng)目的片段十幾kb不能選擇此酶，更換下表二肽酶/三肽酶

3）逆轉(zhuǎn)錄引物

三大類：

1.Oligo dT/錨定Oligo dT

2.隨機(jī)引物：6個(gè)隨機(jī)堿基的結(jié)合，原核生物RNA無poly A尾不能用.Oligo dT/錨定Oligo dT

3.基因特異性引物

原因：在MAP4基因5‘/3’分別設(shè)計(jì)引物，單獨(dú)使用Oligo dT得到的CT值有差異（上圖），單獨(dú)使用逆轉(zhuǎn)錄出來的cDNA有嚴(yán)重的3‘端偏好，建議使用Oligo dT和隨機(jī)引物的混合引物

4）金屬殘留

電泳圖單條帶上方有一個(gè)較大的片段，為金屬DNA殘留

右圖：

綠色：未去除DNA逆轉(zhuǎn)錄出

紅色：未去除未逆轉(zhuǎn)錄，即RNA，不能作為qPCR模板，出現(xiàn)曲線的原因：殘留的DNA引起的有污染曲線

黃色：去除DNA逆轉(zhuǎn)錄（正確）

黃綠相差3個(gè)CT值，建議去除DNA組干擾

3.qPCR

100-200bp時(shí)擴(kuò)增效率才能90%—100%

驗(yàn)證引物的預(yù)實(shí)驗(yàn)：

將模板梯度稀釋——用此引物做pcr——1.熔解曲線：如圖窄窄的單峰=擴(kuò)增特異性強(qiáng)

稀釋倍數(shù)與CT值做標(biāo)曲，求斜率帶入計(jì)算擴(kuò)增效率的公式

查文獻(xiàn)看別人用什么/網(wǎng)站

1.不引入內(nèi)參：在兩組細(xì)胞中，提取RNA——逆轉(zhuǎn)錄——qpcr——得到CT值和ΔCT——代入公式計(jì)算

此實(shí)驗(yàn)不嚴(yán)謹(jǐn)：∵保證取RNA——逆轉(zhuǎn)錄——qpcr的效率均為一致

2.引入內(nèi)參：結(jié)果相反

先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)

三、結(jié)果分析

一）常見圖譜&名詞

1.校正染料

2.擴(kuò)增曲線

• 基線期：熒光背景階段
• 指數(shù)增長期：著重關(guān)注，方程（n≈n0）此時(shí)才適用
• 線性增長期：酶/dNTP不斷消耗
• 平臺(tái)期：

閾值：最低熒光下線的熒光信號(hào)

閾值線決定CT值大小

3.熔解曲線

左圖解釋：PCR反應(yīng)完成后，儀器升溫（60—95℃），此時(shí)雙鏈DNA開始解鏈，熒光信號(hào)下降，至某一數(shù)值陡降，此時(shí)的溫度為Tm。

右圖：每個(gè)鋒代表特異性產(chǎn)物，要求溶解曲線單峰，出現(xiàn)雜峰意味著有非特異性的擴(kuò)增

4.CT值有效性？

1.溶解曲線單峰。如果不是單峰，有非特異性擴(kuò)增的污染導(dǎo)致曲線上升。

2.復(fù)孔間重復(fù)性不好

右下粉色圖：NTC熔解曲線在目的樣本峰形圖前有→認(rèn)為是引物二聚體，可忽略，此時(shí)無論CT值多大均不影響數(shù)據(jù)

右上圖：NTC熔解曲線與目的標(biāo)本的峰圖重合→NTC有污染，此時(shí)NTC的CT比目的基因大3個(gè)或者5個(gè)循環(huán)才可以用。

NRT的CT比目的基因大3個(gè)或者5個(gè)循環(huán)才可以用。

5.合理設(shè)置閾值，放在指數(shù)增長期

左圖：閾值放在中間，接近于直線的區(qū)域

內(nèi)參中的e相近于1，才可以計(jì)算。

e：擴(kuò)增效率

二）數(shù)據(jù)處理

1.相對(duì)定量

1.絕對(duì)定量

標(biāo)準(zhǔn)品很重要，

CDNA不能做標(biāo)準(zhǔn)品原因：濃度不準(zhǔn)確

四、F&Q

一）圖一

二）圖二

基線設(shè)置錯(cuò)誤/模板濃度過高，基線期一般機(jī)器默認(rèn)，但模板投入過多時(shí)默認(rèn)的基線期不再適合，可手動(dòng)調(diào)整

15調(diào)整為10

三）圖三

上圖：儀器程序設(shè)置問題

下圖：定期維護(hù)矯正

左上：主峰前出現(xiàn)雜峰→引物特異性不好/引物二聚體/引物濃度過高/模板濃度過低

右上：主峰后出現(xiàn)雙雜峰→交叉污染/引物特異性差——重新設(shè)計(jì)引物/對(duì)操作環(huán)境清潔

左下：Tm＜80℃→擴(kuò)增片段過短/只有引物二聚體無目的產(chǎn)物——重新設(shè)計(jì)引物/嘗試提高模板濃度退火溫度/降低引物濃度/pcr產(chǎn)物電泳檢測(cè)有無條帶確定模板投入是否正確

右下：熔解曲線峰高低