GB/T 41907-2022 英文版 腸激酶活性檢測(cè)方法

GB/T 41907-2022 英文版

前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。
請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。
本文件由全國(guó)工具酶標(biāo)準(zhǔn)化工作組(SAC/SWG11)提出并歸口。

引言
腸激酶(EC3.4.21.9)是十二指腸細(xì)胞分泌的一種可以在較寬pH范圍(4.5~9.5)和較寬溫度范圍內(nèi)切割含有4個(gè)天冬氨酸的賴氨酸羧基端肽鍵(天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-賴氨酸)的蛋白質(zhì)水解酶。制定腸激酶活性檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),用以推動(dòng)該類工具酶的產(chǎn)業(yè)化,對(duì)于腸激酶的生產(chǎn)和使用具有重要意義。

腸激酶活性檢測(cè)方法
1 范圍
本文件描述了腸激酶活性檢測(cè)方法的試劑或材料、儀器設(shè)備、試驗(yàn)步驟、結(jié)果計(jì)算和質(zhì)量控制。
本文件適用于腸激酶活性的檢測(cè)。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。
GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法
3 術(shù)語(yǔ)和定義
下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。
4 試劑或材料
除非另有規(guī)定,本方法所用的試劑應(yīng)為分析純?cè)噭?所有試劑溶液宜大體積配制、小體積分裝后經(jīng)高壓滅菌后使用,不宜高壓滅菌的試劑應(yīng)用0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌;水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。
4.1 硫氧還蛋白-NP-27(Thioredoxin-NP-27)。
4.2 鹽酸(HCl):量取鹽酸(12mol/L)適量,加入等體積的純化水,配制成濃度為6mol/L。
4.3 氯化鈉(NaCl):固體。
4.4 氯化鈣(CaCl2):固體。
4.5 反應(yīng)緩沖液:50mmol/LTris-HCl,pH8.0(22℃),1mmol/LCaCl2,0.1% Tween-20。
4.6 硫氧還蛋白-NP-27(Thioredoxin-NP-27)溶液:稱取硫氧還蛋白-NP-27(Thioredoxin-NP-27)約25mg,用反應(yīng)緩沖液溶解并定容至25mL,配制成每毫升含1mg硫氧還蛋白-NP-27(Thioredoxin-NP-27)的溶液,紫外分光光度法檢測(cè)蛋白濃度后再稀釋成每毫升含0.1mg蛋白的溶液。
4.7 腸激酶溶液:稱取腸激酶適量,用反應(yīng)緩沖液溶解并配制成每毫升含1mg蛋白的溶液,再稀釋成每毫升含0.1mg蛋白的溶液。
4.8 2×SDS凝膠加樣緩沖液:量取或稱取10mL1mol/LTris-HCl,pH6.8,10mLβ-巰基乙醇,4gSDS,0.2g溴酚藍(lán),20mL甘油,加水定容至100mL。
5 儀器設(shè)備
紫外分光光度計(jì)、恒溫培養(yǎng)箱、電泳儀、電泳槽、電子分析天平(感量:0.0001g)。
6 試驗(yàn)步驟
6.1 酶切反應(yīng)
取離心管8支,各加入硫氧還蛋白-NP-27(Thioredoxin-NP-27)溶液40μL,再依次分別加入腸激酶溶液0μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL,再依次分別加入反應(yīng)緩沖液10μL、8μL、7μL、6μL、5μL、4μL、3μL、2μL,置于37℃±0.5℃水浴中,反應(yīng)16h后,各加入50μL的2×SDS凝膠加樣緩沖液終止酶切反應(yīng),分別取各反應(yīng)液20μL,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。
6.2 電泳
12%SDS-PAGE凝膠電泳,電壓90V~120V,當(dāng)溴酚藍(lán)線到達(dá)凝膠板底部時(shí)停止電泳,取出凝膠進(jìn)行染色30min,并過(guò)夜脫色至無(wú)底色。當(dāng)融合蛋白電泳條帶看不見(jiàn)時(shí),表明此時(shí)的腸激酶量恰好能將該融合蛋白樣品完全酶切,并以此反應(yīng)體系作為依據(jù)計(jì)算酶活性。
8 質(zhì)量控制
在重復(fù)性條件下,獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過(guò)算術(shù)平均值的10%。