大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。

水牛（Bubalus bubalis）是熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，但水牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到但其低繁殖力的極大限制。體外胚胎生產(chǎn)（in vitro embryo production，IVEP）和體細(xì)胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）等胚胎生物技術(shù)可以加速水牛的遺傳育種，并促進(jìn)水牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。然而，低囊胚發(fā)育率（26.5%–39.48%）影響了其廣泛應(yīng)用。受精后，受精卵將發(fā)生卵裂，其發(fā)育將從母體過渡到合子，這一過程稱為母源-合子轉(zhuǎn)換（maternal-to-zygotic transition，MZT），與胚胎基因組激活（embryonic genome activation，EGA）相關(guān)。植入前胚胎在MZT過程中經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳重編程高度變化。探索水牛植入前胚胎發(fā)育（pre-implantation embryo development，PED）與EGA相關(guān)分子機(jī)制具有重要意義。但水牛EGA過程中發(fā)生的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳復(fù)雜調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

2023年7月11日，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西大學(xué)) 伏彭輝博士和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所張杜博士為并列第一作者，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西大學(xué))石德順教授和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所高飛研究員為共同通訊作者，在《J Anim Sci Biotechnol》雜志發(fā)表題為“Whole-genome transcriptome and DNA methylation dynamics of pre-implantation embryos reveal progression of embryonic genome activation in buffaloes”的研究論文。該研究通過對(duì)水牛的生發(fā)泡（germinal vesicle，GV）卵母細(xì)胞、中期Ⅱ（metaphase II，MII）卵母細(xì)胞以及體外受精（in vitro fertilization，IVF）胚胎的7個(gè)關(guān)鍵階段（受精卵、2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞、16細(xì)胞、桑椹胚和囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass ，ICM)）進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）和單細(xì)胞全基因組重亞硫酸鹽測序（scWGBS）分析，繪制了水牛植入前胚胎的轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化圖譜。構(gòu)建了水牛植入前胚胎發(fā)生的完整基因表達(dá)時(shí)間序列，闡明了水牛MZT過程中的EGA和遺傳程序，鑒定了水牛MZT過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄特征和表觀遺傳修飾，并深入了解了與EGA相關(guān)的分子機(jī)制。深圳市易基因科技有限公司提供本研究的單細(xì)胞DNA甲基化測序（scWGBS）和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）分析服務(wù)。

標(biāo)題：Whole-genome transcriptome and DNA methylation dynamics of pre-implantation embryos reveal progression of embryonic genome activation in buffaloes（植入前胚胎的全基因組轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化動(dòng)態(tài)變化揭示了水牛胚胎基因組激活進(jìn)展）

發(fā)表期刊：Journal of Animal Science and Biotechnology

發(fā)表日期：2023年07月11日

影響因子：IF 7

技術(shù)：單細(xì)胞全基因組重亞硫酸鹽測序（scWGBS）、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）等

研究摘要

在哺乳動(dòng)物植入前胚胎發(fā)育（PED）過程中，母源-合子轉(zhuǎn)換（MZT）過程通過表觀遺傳修飾和基因表達(dá)來調(diào)控，并與胚胎基因組激活（EGA）有關(guān)。在MZT期間，胚胎對(duì)環(huán)境敏感，易在體外停滯。然而，水牛EGA的發(fā)生時(shí)間和調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

本研究對(duì)水牛植入前胚胎進(jìn)行基于單細(xì)胞的RNA-seq和全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS），以繪制轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化圖譜。水牛PED過程中分為四個(gè)典型的發(fā)育階段。通過基因表達(dá)和DNA甲基化變化綜合分析，在16細(xì)胞期鑒定出水牛的主要EGA。通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）揭示了水牛母源-合子轉(zhuǎn)換過程中的階段特異性模塊，并進(jìn)一步揭示了關(guān)鍵信號(hào)通路和生物過程事件。這些通路的程序化和持續(xù)激活促進(jìn)了水牛EGA成功。此外研究結(jié)果還表明hub基因CDK1在水牛EGA中起關(guān)鍵作用。

本研究繪制了水牛PED中的轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化圖譜，并深入揭示了水牛EGA的分子機(jī)制和水牛MZT期間的遺傳編程，這將為改善水牛胚胎的體外發(fā)育奠定基礎(chǔ)。

（1）水牛植入前胚胎發(fā)育（PED）過程中的轉(zhuǎn)錄組圖譜

圖1：水牛PED過程中的轉(zhuǎn)錄組圖譜。

1. 水牛卵母細(xì)胞和胚胎的顯微圖像。上圖為卵母細(xì)胞/胚胎及其透明帶。下圖為無透明帶的卵母細(xì)胞/胚胎。從1到9：GV卵母細(xì)胞、MII卵母細(xì)胞、受精卵、2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞、16細(xì)胞、桑椹胚、囊胚（下圖中ICM從胚泡中分離）。

2. 所有發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄本的主成分分析（PCA）。

3. 無監(jiān)督分層聚類和重復(fù)樣本的熱圖。

4. 水牛PED過程中連續(xù)發(fā)育階段的DEG數(shù)量。

5. 每個(gè)胚胎發(fā)育階段母體基因表達(dá)抑制的數(shù)量。

6. 每個(gè)胚胎發(fā)育階段首次表達(dá)基因數(shù)量

（2）水牛PED過程中的DNA甲基化圖譜

圖2：水牛PED過程中的DNA甲基化圖譜。

1. 每個(gè)發(fā)育階段的全基因組CpG甲基化水平。

2. CpG平均甲基化水平（基因體±5 kb）。

3. 每個(gè)發(fā)育階段CpG不同甲基化水平分布百分比。

4. 水牛PED過程中連續(xù)發(fā)育階段的DMR數(shù)量。

5. 幾個(gè)成對(duì)比較中，全基因組中的DMR分布（a：GV卵母細(xì)胞與MII卵母細(xì)胞；b：MII卵母細(xì)胞與受精卵；c：受精卵與2細(xì)胞；d：2細(xì)胞與4細(xì)胞；e：4細(xì)胞與8細(xì)胞；f：8細(xì)胞與16細(xì)胞；g：16細(xì)胞與桑椹胚；h：桑椹胚與ICM）。

6. 以8細(xì)胞期為例，CpG甲基化水平與不同表達(dá)水平（高、中、低和不表達(dá)）相關(guān)的變化趨勢(shì)

（3）WGCNA鑒定階段特異性共表達(dá)模塊

圖3：利用WGCNA進(jìn)行階段特異性基因共表達(dá)分析。

1. 共表達(dá)基因模塊的聚類樹狀圖。

2. 共表達(dá)模塊與胚胎發(fā)育階段之間相關(guān)性的熱圖。

3. 水牛PED過程中發(fā)育步驟示意圖

（4）水牛EGA過程中的遺傳程序動(dòng)態(tài)變化

圖4：主要EGA前富集KEGG通路的互作網(wǎng)絡(luò)。六邊形：2細(xì)胞期；矩形：4細(xì)胞期；三角形：8細(xì)胞期

圖5：16細(xì)胞期的富集通路和重要KEGG通路分析。

1. KEGG通路在16細(xì)胞期富集。

2. 水牛PED過程中關(guān)鍵通路的全基因組激活

（5）關(guān)鍵hub基因的鑒定

圖6：MZT過程中關(guān)鍵hub基因的鑒定。

1. 十大hub基因列表。

2. EGA過程中CDK1的調(diào)控通路和相關(guān)hub基因。

圖7：CDK1富集生物過程的表達(dá)熱圖

研究結(jié)論：

本研究利用單細(xì)胞RNA-seq和單細(xì)胞WGBS技術(shù)對(duì)水牛卵母細(xì)胞和植入前胚胎的全基因組轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化進(jìn)行了測序分析，繪制了水牛胚胎發(fā)生過程中的全基因組轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化圖譜。根據(jù)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)特征和DNA甲基化變化，揭示了水牛主要EGA發(fā)生在胚胎發(fā)育的16細(xì)胞期。在水牛MZT過程中，hub基因和信號(hào)通路的順序激活對(duì)于水牛EGA和水牛PED的遺傳編程至關(guān)重要。本研究為了解水牛胚胎發(fā)生的分子機(jī)制提供重要的補(bǔ)充信息，并為改善水牛胚胎的體外發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)于易基因單細(xì)胞及微量樣本DNA甲基化測序(Micro DNA-BS)

單細(xì)胞及微量樣本的DNA甲基化組學(xué)研究很大程度上受制于建庫技術(shù)。傳統(tǒng)的文庫構(gòu)建方法或類似于基因組DNA的單細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)很難應(yīng)用到甲基化實(shí)驗(yàn)過程中。易基因建立了一系列微量及單細(xì)胞甲基化檢測方法，可對(duì)于不同項(xiàng)目需求，個(gè)性化提供檢測方案，在全基因組、簡化基因組、靶基因等范圍開展甲基化檢測。

易基因建立的單細(xì)胞及微量樣本DNA甲基化測序技術(shù)包括：

• 單細(xì)胞全基因組甲基化測序（scWGBS）

• 單細(xì)胞簡化基因組甲基化測序（scXRBS）

• 微量樣本全基因組甲基化測序（Micro DNA-WGBS）

• 微量細(xì)胞或DNA簡化基因組甲基化測序（Micro DNA-XRBS）

應(yīng)用方向：

單細(xì)胞及微量珍稀樣本的甲基化研究主要應(yīng)用于腫瘤發(fā)生機(jī)制，癌癥研究，胚胎植入前診斷，胚胎早期發(fā)育，生殖細(xì)胞重組，干細(xì)胞及細(xì)胞異質(zhì)性等研究領(lǐng)域。應(yīng)用的樣本包括單細(xì)胞、微量細(xì)胞、微量DNA等。特別適用于難以取得的珍稀樣本和細(xì)胞異質(zhì)性較大的組織樣本。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

1）微量細(xì)胞或單細(xì)胞全基因組甲基化測序（Micro DNA-WGBS）DNA起始量：

單細(xì)胞/100-1000個(gè)細(xì)胞

1ng基因組DNA

90%以上基因組CG覆蓋

2）微量細(xì)胞或DNA簡化基因組甲基化測序（Micro DNA-XRBS）DNA起始量：

1ng基因組DNA；

10-20M有效CG位點(diǎn)覆蓋；

20G測序數(shù)據(jù)量。

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整體解決方案，詳詢易基因：0755-28317900。

參考文獻(xiàn)：

Fu P, Zhang D, Yang C, Yuan X, Luo X, Zheng H, Deng Y, Liu Q, Cui K, Gao F, Shi D. Whole-genome transcriptome and DNA methylation dynamics of pre-implantation embryos reveal progression of embryonic genome activation in buffaloes. J Anim Sci Biotechnol. 2023 Jul 11;14(1):94.