皮質(zhì)醇ELISA試劑盒運(yùn)用雙抗體夾心ELISA法定量測(cè)定其他血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體中皮質(zhì)醇含量。

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艾美捷皮質(zhì)醇ELISA試劑盒#K003-H1：

檢測(cè)范圍：0.375nmol/L~12nmol/L

靈敏度：0.1

實(shí)驗(yàn)原理：將皮質(zhì)醇(Cor)抗體包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本，其中的皮質(zhì)醇(Cor)與連接于固相載體上的抗體結(jié)合，然后加入生物素化的皮質(zhì)醇(Cor)抗體，將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后，加入HRP標(biāo)記的親和素，再次徹底洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成*終的黃色。顏色的深淺和樣品中的皮質(zhì)醇呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(0.D.值),計(jì)算樣品濃度。

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皮質(zhì)醇ELISA試劑盒組分：

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皮質(zhì)醇ELISA試劑盒需自備的設(shè)備及試劑：

1. 450±10m濾光片的酶標(biāo)儀(建議儀器使用前提前預(yù)熱)

2.?單道或多道微量加液器及吸頭

3.?稀釋樣品的印管

4.?蒸餾水或去離子水

5.?吸水紙

6.?盛放洗液的容器

試劑盒的儲(chǔ)存及有效期：

1.?未開封的試劑盒：所有試劑均按試劑瓶標(biāo)簽上所示保存。請(qǐng)注意，收到試劑盒后請(qǐng)盡快將TMB洗滌液，終止液保存于4℃,其他試劑保存于-20℃。

2.?使用后的試劑盒：剩余試劑仍需按照試劑瓶標(biāo)簽所示的溫度保存，開封后的酶標(biāo)板要加干燥劑后密封保存于-20°℃,避免潮濕。

注意：

試劑盒內(nèi)酶標(biāo)條可拆卸，按實(shí)驗(yàn)需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在*實(shí)驗(yàn)后1個(gè)月內(nèi)使用完畢。產(chǎn)品過期時(shí)間以盒子上的標(biāo)簽為準(zhǔn)，保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。

皮質(zhì)醇ELISA試劑盒標(biāo)本的采集與保存：

1.?血清：

將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4°℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80°℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.?血漿：

用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8°℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20°℃或-80°℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.組織勻漿：

1)取適量組織塊，于預(yù)冷PBS(0.01mol/L.pH 7.0-7.2)中清洗去除血液，稱重后備用(組織塊較大需先剪碎后再勻漿);

2)可同時(shí)選用多種勻漿方法達(dá)到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入5-10mL預(yù)冷PBS進(jìn)行充分研磨，該過程需在冰上進(jìn)行(有條件實(shí)驗(yàn)室可選用機(jī)器勻漿);得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復(fù)凍融進(jìn)一步處理(超聲破碎過程中注意冰浴降溫；反復(fù)凍融法可重復(fù)2次)。

3)將制備好的勻漿液于5000×g離心5分鐘，留取上清即可檢測(cè)。

4.細(xì)胞裂解液：

1)貼壁細(xì)胞需要先用胰酶消化，離心收集細(xì)胞(懸浮細(xì)胞可直接離心收集);

2)將收集到的細(xì)胞用冷PBS洗3次；

3)物理方法裂解細(xì)胞(可先超聲破碎細(xì)胞，再反復(fù)凍融):

i超聲破碎：取適量PBS重懸細(xì)胞，用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂。

ii反復(fù)凍融：將待破碎的細(xì)胞在-200C以下冰凍，室溫融解，反復(fù)3次，使細(xì)胞溶脹破碎。

4)將標(biāo)本于2-8 °℃1500×g離心10分鐘，收集上清備用。

5.細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它生物標(biāo)本：

請(qǐng)1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20°℃或-80°℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注意：

1.?以上標(biāo)本均需密封保存，4℃保存應(yīng)小于1周，-20℃不應(yīng)超過1個(gè)月，-80°℃不應(yīng)超過2個(gè)月。

2.?標(biāo)本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。

3.?實(shí)驗(yàn)前紅細(xì)胞裂解液必須用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋。

皮質(zhì)醇ELISA試劑盒試劑準(zhǔn)備

1.?使用前將所有的試劑和標(biāo)本緩慢均衡至室溫(18-250C),試劑不能直接在370C溶解。

2.?標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品):每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1mL,蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為1000ng/mL。準(zhǔn)備7個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的印管，每個(gè)EP管中加入150μL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，依次倍比稀釋成不同的梯度， 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(0pg/mL)直接作為空白孔。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

3.?濃洗滌液：用580mL蒸餾水或去離子水將20mL濃洗滌液稀釋至600mL,進(jìn)行30倍稀釋。

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皮質(zhì)醇ELISA試劑盒操作步驟：

1.?加樣：分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μ1,待測(cè)樣品孔中先加樣品

稀釋液40μ1,然后再加待測(cè)樣品10μ (樣品*終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

2.?溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

3.?配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用

4.?洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

5.?加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μ1,空白孔除外。

6.?溫育：操作同3。

7.?洗滌：操作同5。

8.?顯色：每孔先加入顯色劑A50μ1,再加入顯色劑B50μ1,輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

9.?終止：每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

10.?測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(0D值)。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

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特異性

本試劑盒用于檢測(cè)皮質(zhì)醇(Cor),經(jīng)檢測(cè)與其它相似物質(zhì)無(wú)明顯交叉反應(yīng)。

由于受到技術(shù)及樣本來源的限制，不可能完成對(duì)所有相關(guān)或相似物質(zhì)交叉反應(yīng)檢測(cè)，因此本試劑盒有可能與未經(jīng)檢測(cè)的其它物質(zhì)有交叉反應(yīng)。

精密度

精密度用樣品測(cè)定值的變異系數(shù)CV表示。CV(%)= SD/mean×100

批內(nèi)差：取同批次試劑盒對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量檢測(cè).每份樣本連續(xù)測(cè)定20次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批間差：選取3個(gè)不同批次的試劑盒分別對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量測(cè)定，每個(gè)樣本使用同一試劑盒重復(fù)測(cè)定8次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批內(nèi)差：?CV<10%

批間差：?CV<12%

皮質(zhì)醇ELISA試劑盒穩(wěn)定性：

經(jīng)測(cè)定，試劑盒在有效期內(nèi)按推薦溫度保存，其活性降低率小于5%。

為減小外部因素對(duì)試劑金破壞前后檢測(cè)值的影響，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗(yàn)員來進(jìn)行操作可減少人為誤差。