寫在前面

????????今天推薦的是由成均館大學(xué)醫(yī)學(xué)院在2020年1月14日發(fā)表于Cancers（2020IF：6.639，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Kyeong Kyu Kim教授，研究表明泛素特異性蛋白酶21通過充當(dāng)Fra-1去泛素酶促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。

研究背景

????????Fos-related-antigen-1(Fra-1)是激活蛋白-1（AP-1）轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員，在癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，F(xiàn)ra-1被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移性癌癥包括轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）的治療目標(biāo)。然而，其在蛋白質(zhì)水平上的調(diào)節(jié)功能尚未清楚闡明。

摘要部分

????????作者發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶21(USP21)通過去泛素化Fra-1來增加Fra-1的穩(wěn)定性，并增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞中Fra-1靶基因的表達(dá)。作者還表明USP21控制依賴Fra-1的遷移和入侵活動。當(dāng)USP21敲低的癌細(xì)胞被脾內(nèi)注射到小鼠體內(nèi)時，USP21的致癌特性通過肝轉(zhuǎn)移的顯著減少得到證實。一致地，結(jié)直腸癌患者的臨床病理學(xué)分析揭示了USP21表達(dá)與高級別癌和壽命的相關(guān)性。這些結(jié)果表明USP21通過去泛素化Fra-1來增強(qiáng)Fra-1穩(wěn)定性和AP-1靶基因表達(dá)。因此，USP21被認(rèn)為是具有高Fra-1表達(dá)的mCRC的有前景的治療靶點。

研究內(nèi)容

1.USP21結(jié)合并調(diào)節(jié)Fra-1表達(dá)

????????作者篩選了在293T細(xì)胞中增強(qiáng)AP-1熒光素酶報告基因活性的DUB。研究發(fā)現(xiàn)USP21可以導(dǎo)致AP-1轉(zhuǎn)錄活性和Fra-1表達(dá)的最大增強(qiáng)。因此，作者假設(shè)USP21是Fra-1DUB，并進(jìn)一步研究了其在調(diào)節(jié)Fra-1表達(dá)中的作用。為了研究USP21影響AP-1轉(zhuǎn)錄活性的分子機(jī)制，定量了結(jié)腸癌中Fra-1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。首先，作者在兩種結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和HT-29中確定了USP21在USP21敲低條件下對穩(wěn)定Fra-1的影響。siUSP21以劑量依賴性方式顯著降低Fra-1蛋白。為了進(jìn)一步研究USP21是否與Fra-1相互作用，作者在293T細(xì)胞中進(jìn)行了免疫沉淀。該結(jié)果表明USP21和Fra-1之間存在相互的相互作用。

研究結(jié)論：USP21結(jié)合并調(diào)節(jié)Fra-1表達(dá)。

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2.Fra-1蛋白被蛋白酶體降解? ? ?

????????為了確定Fra-1穩(wěn)定性是否受泛素化依賴性蛋白酶體途徑的負(fù)向控制，作者探究了用蛋白酶體抑制劑MG-132處理后HCT116細(xì)胞中Fra-1的蛋白質(zhì)降解?？偧?xì)胞裂解物的分析顯示Fra-1蛋白的時間依賴性、連續(xù)積累。此外，為了研究Fra-1穩(wěn)定性是否受DUB依賴性去泛素化正調(diào)控，將編碼USP21的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HCT16細(xì)胞中。與缺乏MG-132處理的細(xì)胞相比，USP21的異位表達(dá)進(jìn)一步增加了Fra-1的表達(dá)。

????????為了檢查MG-132和USP21對Fra-1的影響，作者接下來通過免疫染色觀察了Fra-1蛋白的細(xì)胞分布。Fra-1存在于細(xì)胞核中，但在MG-132處理后也分布在細(xì)胞質(zhì)中。與Fra-1相反，USP21蛋白出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中。

研究結(jié)論：Fra-1蛋白被蛋白酶體降解。

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3.USP21用作Fra-1DUB

????????為了研究USP21的催化活性是否影響Fra-1的穩(wěn)定性，構(gòu)建了編碼突變體USP21 (C221A)的質(zhì)粒構(gòu)建體，該突變體缺乏催化活性。接下來，為了確定USP21是否通過其酶活性促進(jìn)Fra-1的去泛素化，作者探究了總細(xì)胞裂解物和來自不同293T的Fra-1免疫沉淀（IP）樣品中泛素化(Ub)的程度。WT USP21的過表達(dá)導(dǎo)致總細(xì)胞裂解物中泛素化蛋白的減少。然而，C221A USP21的過度表達(dá)并沒有改變泛素化水平。與這一觀察結(jié)果一致，siRNA對USP21表達(dá)的降低促進(jìn)了Fra-1的泛素化，而加入WT USP21可以逆轉(zhuǎn)這種情況。這些結(jié)果表明Fra-1是USP21的底物，其穩(wěn)定性受泛素化控制。一致地，在放線菌酮(CHX)存在下，HCT116細(xì)胞中的USP21過表達(dá)明顯增加了Fra-1蛋白的半衰期。

研究結(jié)論：USP21是結(jié)腸癌細(xì)胞中Fra-1蛋白質(zhì)穩(wěn)定性所必需的，研究表明USP21是Fra-1的DUB。

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4.USP21調(diào)節(jié)Fra-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性? ? ?

????????作者使用結(jié)腸癌細(xì)胞中的熒光素酶報告基因檢測了USP21對Fra-1依賴性AP-1轉(zhuǎn)錄活性的影響。與WT USP21過表達(dá)的影響相反，USP21敲低顯著降低了AP-1轉(zhuǎn)錄活性。然而，WT USP21與USP21敲低細(xì)胞的互補(bǔ)導(dǎo)致AP-1轉(zhuǎn)錄活性的恢復(fù)。

????????作者通過測量MMP-1的表達(dá)來研究USP21對Fra-1活性的影響，MMP-1是Fra-1的靶基因，因為AP-1與MMP-1啟動子結(jié)合。作者通過對Fra-1轉(zhuǎn)染后的MMP-1啟動子進(jìn)行熒光素酶檢測，并在USP21敲低后測量USP21對Fra-1活性的影響。USP21敲低明顯降低了Fra-1活性。作者還在相同條件下通過定量實時PCR分析測量了MMP-1mRNA表達(dá)。當(dāng)Fra-1誘導(dǎo)MMP-1表達(dá)時，USP21敲低降低了Fra-1對MMP-1表達(dá)的影響。相反，USP21敲低細(xì)胞中USP21的過表達(dá)增強(qiáng)了MMP-1的表達(dá)。通過蛋白印跡發(fā)現(xiàn)，siUSP21降低了Fra-1的蛋白質(zhì)表達(dá)，但用USP21基因轉(zhuǎn)染恢復(fù)了Fra-1表達(dá)。為了比較WT和突變體(C221A) USP21之間的差異，作者分析了Fra-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。與AP-1熒光素酶報告基因檢測結(jié)果一致，作者發(fā)現(xiàn)突變體USP21對MMP-1啟動子活性或MMP-1的mRNA水平?jīng)]有影響?？傊?，這些結(jié)果證實了在這些條件下Fra-1蛋白水平增強(qiáng)，并且USP21的催化活性穩(wěn)定了Fra-1蛋白。然而，USP21過表達(dá)對Fra-1基因表達(dá)沒有顯著差異。

研究結(jié)論：USP21通過增加Fra-1蛋白的表達(dá)水平來促進(jìn)Fra-1介導(dǎo)的MMP-1表達(dá)。

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5.USP21與結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移活動有關(guān)

????????Fra-1在結(jié)腸癌中的表達(dá)水平與細(xì)胞遷移和侵襲密切相關(guān)。因此，作者探究了USP21對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和HT29中遷移和侵襲活性的影響。首先，作者驗證了Fra-1表達(dá)增強(qiáng)了遷移活動。首先，作者驗證了Fra-1的表達(dá)增強(qiáng)了遷移活性。然后，作者比較了Fra-1與USP21或siUSP21共同表達(dá)Fra-1的遷移活性。作者發(fā)現(xiàn)USP21顯著增加了癌細(xì)胞的遷移活性，并且USP21敲低減少了細(xì)胞遷移。一致地，癌細(xì)胞的侵襲活性被USP21顯著誘導(dǎo)，而USP21敲低降低了Fra-1效應(yīng)。作者還證實Fra-1水平也與癌細(xì)胞遷移和入侵能力成正比。

研究結(jié)論：USP21通過控制Fra-1活性與結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移相關(guān)。

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6.USP21表達(dá)在結(jié)直腸癌組織中上調(diào)并與不良預(yù)后相關(guān)

????????為了進(jìn)一步證實USP21在結(jié)直腸癌中的作用，使用免疫組織化學(xué)檢查了297名結(jié)直腸癌(CRC)患者樣本中USP21的表達(dá)，并分析了與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。USP21在患者腫瘤樣本中的表達(dá)由免疫組織化學(xué)(IHC)評分表示。與正常細(xì)胞和腺瘤細(xì)胞相比，結(jié)直腸腺癌細(xì)胞中的USP21表達(dá)顯著增強(qiáng)。CRC患者樣本中USP21表達(dá)的IHC圖像也說明了USP21表達(dá)與癌癥分期之間的相關(guān)性。此外，與早期階段相比，第4階段結(jié)直腸癌中的USP21水平顯著增加。有趣的是，在具有頻繁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和大量內(nèi)淋巴腫瘤栓子的結(jié)直腸癌中，USP21表達(dá)顯著提高。與這些發(fā)現(xiàn)一致，結(jié)直腸癌細(xì)胞中USP21的表達(dá)與不良預(yù)后顯著相關(guān)。

研究結(jié)論：USP21在結(jié)直腸癌發(fā)展和癌癥轉(zhuǎn)移中的致癌作用。

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7.USP21對體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響

????????由于這項研究表明USP21與結(jié)腸癌中增強(qiáng)的遷移和侵襲活性相關(guān)，作者探究了USP21對小鼠模型中癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。將對照組WT HCT116和實驗組USP21敲低HCT116脾內(nèi)注射裸鼠中，然后進(jìn)行脾切除術(shù)。磁共振成像(MRI)每周監(jiān)測每組的肝轉(zhuǎn)移率，注射后第14天確認(rèn)對照組的肝轉(zhuǎn)移。在第23天處死小鼠并對其腫瘤進(jìn)行表征。兩組均在肝臟中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性腫瘤。然而，USP21敲低實驗組中的腫瘤更小且數(shù)量較少，如腫瘤形成區(qū)域的百分比所示。該結(jié)果與USP21敲低細(xì)胞的遷移和侵襲活性降低一致。這些結(jié)果表明USP21有助于癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移。為了進(jìn)一步證實USP21對腫瘤進(jìn)展的促進(jìn)作用，通過免疫組織化學(xué)檢查了來自對照組和實驗組的腫瘤組織中USP21和Fra-1的表達(dá)水平。該分析表明，相對于對照組，HCT116-shUSP21實驗組的Fra-1水平顯著降低。

研究結(jié)論：USP21的表達(dá)升高與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。

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結(jié)論與討論

????????以前，作者通過監(jiān)測轉(zhuǎn)染DUB編碼質(zhì)粒后泛素化蛋白總量來篩選在293T細(xì)胞中表現(xiàn)出強(qiáng)去泛素化活性的DUB。這一過程導(dǎo)致鑒定出20個屬于USP亞家族的DUB。在測試的DUB中，作者新發(fā)現(xiàn)USP21作為Fra-1 DUB在CRC中發(fā)揮致癌作用，并調(diào)節(jié)參與癌癥轉(zhuǎn)移的Fra-1靶基因。此外，本研究表明，使用小鼠模型，uSP21敲低可減少體內(nèi)腫瘤形成和癌癥轉(zhuǎn)移，并且USP21表達(dá)在結(jié)直腸癌患者中上調(diào)。最后，作者建議將USP21下調(diào)作為mCRC的潛在治療策略。

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Thank you!

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原文鏈接:https://www.mdpi.com/2072-6694/12/1/207