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今天給同學們分享一篇機器學習+分型的生信文章“Comprehensive bioinformatics analysis reveals the crosstalk genes and immune relationship between the systemic lupus erythematosus and venous thromboembolism”，這篇文章于2023年7月3日發(fā)表在Front Immunol期刊上，影響因子為8.786。

眾所周知，系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者患有靜脈血栓栓塞（VTE）的風險較高。本研究旨在初步確定SLE和VTE之間的相互作用基因，并探索它們的臨床價值和分子機制。

1. VTE和SLE隊列中的CGs鑒定

在SLE數(shù)據(jù)集GSE61635中，共鑒定出3321個差異表達基因（DEGs），其中包括2492個上調(diào)的DEGs和829個下調(diào)的DEGs（圖1A）。在VTE數(shù)據(jù)集GSE19151中，共鑒定出768個DEGs，其中包括421個上調(diào)的DEGs和347個下調(diào)的DEGs（圖1B）。如圖1C所示的Venn圖表明，SLE和VTE隊列之間有171個重疊的共同基因（CGs）。表達矩陣的PCA分析表明，疾病組和對照組的樣本分布在兩側(cè)明顯可見（圖1D）。熱圖顯示了VTE和SLE隊列中CGs的表達模式（圖1E，F(xiàn)）。

圖1 差異表達基因分析

2. CG的富集分析

進行了GO和KEGG富集分析以研究CGs的生物功能。結(jié)果表明，CGs主要富集在免疫和炎癥途徑中，包括B/T細胞受體信號通路、白細胞介素-2產(chǎn)生、T細胞分化、T細胞激活和趨化因子信號通路（圖2A、B）。此外，VTE隊列的GSVA結(jié)果顯示，與VTE組相比，正常組主要富集了免疫和炎癥途徑，如調(diào)節(jié)適應性免疫應答、免疫應答的激活、趨化因子產(chǎn)生和自然殺傷細胞介導的免疫應答（圖2C）。SLE隊列的GSVA結(jié)果表明，與正常組相比，SLE組主要富集了免疫途徑，包括B細胞激活的正調(diào)節(jié)、先天免疫應答的激活、肥大細胞激活和對趨化因子的反應（圖2D）。這兩種疾病的免疫應答模式似乎不同。還應用了GSEA評估了CGs所涉及的信號通路。結(jié)果表明，CGs與VTE中的免疫途徑（TNF信號通路、B細胞受體信號通路和Th1/Th2/Th17細胞分化）呈負相關（圖2E），與SLE中的免疫反應（TNF信號通路、IL-17信號通路和NOD樣受體信號通路）呈正相關（圖2F）。這些結(jié)果說明CGs參與了SLE和VTE中免疫功能的調(diào)節(jié)。

圖2 功能富集和通路富集分析

3. 尋找最佳的共享診斷CGs

在GSE61635中，套索回歸算法在最合適的λ=0.14下確定了八個診斷性CpG位點（圖3A）。在GSE19151中，套索回歸算法在最合適的λ=0.061下確定了七個診斷性CpG位點（圖3B）。三個重疊的CpG位點（HSP90AB1、FPR2和RSAD2）被篩選為SLE和VTE的最佳共享診斷性CpG位點（圖3C）。圖3D-G展示了這三個候選生物標志物在SLE（GSE61635和GSE50772）和VTE數(shù)據(jù)集（GSE19151和GSE48000）中的差異基因表達模式。與對照組相比，F(xiàn)PR2和RSAD2在SLE組中上調(diào)，而HSP90AB1下調(diào)。與此同時，F(xiàn)PR2和HSP90AB1在VTE組中下調(diào)，而RSAD2上調(diào)。然后，作者使用ROC曲線驗證了HSP90AB1、FPR2和RSAD2在SLE數(shù)據(jù)集和VTE數(shù)據(jù)集中的診斷效能，結(jié)果顯示它們在疾病鑒定方面表現(xiàn)出強大的性能（圖3H）。三個候選生物標志物的單變量邏輯回歸分析也顯示它們能夠準確區(qū)分患者和健康個體（圖3I）。

圖3 潛在共享診斷CG的鑒定

4. 建立和驗證SLE和VTE風險評分

在GSE61635和GSE19151中，三個變量之間的相關性在圖4A中有所說明。在GSE61635中，HSP90AB1和FPR2之間的相關系數(shù)為0.75。作者認為這兩個變量之間存在較高的多重共線性可能性。因此，作者移除了FPR2，并進一步將HSP90AB1和RSAD2納入多元邏輯回歸模型以建立預測分數(shù)（圖4B）?；貧w結(jié)果表明，HSP90AB1在SLE和VTE中是一個獨立的保護因子，而RSAD2則是一個獨立的風險因子。在SLE和VTE隊列中，校準圖中的偏差校正線與理想曲線接近，表明預測模型具有良好的一致性（圖4C）。SLE和VTE風險模型的C指數(shù)超過了單一單因素風險模型的C指數(shù)，這表明作者的風險評分對于預測這些疾病具有良好的效果（圖4D）。圖4E展示了兩個風險評分的預測潛力，使用了ROC曲線。在GSE61635上，SLE風險評分的ROC曲線下面積（AUC）為0.98，而在GSE19151上，VTE風險評分的AUC為0.95?；赟LE和VTE風險評分分別構(gòu)建了兩個診斷圖，為臨床醫(yī)生提供了量化預測疾病風險的方法（圖4F，G）。此外，外部驗證分析的結(jié)果也證明了這兩個風險評分具有出色的預測性能。在GSE50772和GSE48000中，這兩個風險評分的準確率、精確度、召回率和F-measure都超過了0.75（圖5A，B）?；谕獠繑?shù)據(jù)的校準曲線（圖5C，D）和ROC曲線（圖5E，F(xiàn)）驗證了它們可靠地預測疾病的性能。SLE和VTE聯(lián)合數(shù)據(jù)集的ROC曲線表明這兩個風險評分具有出色的性能。

圖4 風險評分的構(gòu)建

圖5 VTE和SLE風險評分的外部驗證

5. 關鍵基因的PPI網(wǎng)絡

為了確定CGs的潛在相互作用，作者使用Cytoscape軟件根據(jù)STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了一個PPI網(wǎng)絡，整合了28個節(jié)點和64條邊（圖6A）。接下來，作者使用四種不同的拓撲分析方法（MCC、MNC、EPC和度）從CGs中提取了中心基因。這四種算法的結(jié)果都指向了五個中心CGs：MMP9、FOS、IGF1R、PIK3R1和CXCL8（圖6B）。與相應的對照組相比，這五個中心CGs在外部數(shù)據(jù)集（GSE19151和GSE61635）和內(nèi)部數(shù)據(jù)集（GSE48000和GSE50772）中都明顯上/下調(diào)（圖6C-F）。

圖6 PPI網(wǎng)絡和基因表達驗證分析

6. VTE和SLE隊列中免疫微環(huán)境的比較

為了進一步探索VTE和SLE隊列中的免疫景觀，使用CIBERSORT算法計算了每個樣本中22種免疫細胞的百分比。在GSE61635中，大部分免疫細胞，如中性粒細胞、CD8 T細胞、幼稚CD4 T細胞、單核細胞、激活的CD4 T記憶細胞、靜止的NK細胞、幼稚B細胞和濾泡輔助樣T細胞，明顯浸潤在SLE組而不是正常組（圖7A）。在GSE19151中，大部分免疫細胞，如單核細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、激活的記憶CD4 T細胞、CD8 T細胞、幼稚CD4 T細胞、幼稚B細胞、靜止的NK細胞和巨噬細胞，明顯浸潤在正常組而不是VTE組（圖7B）。這些結(jié)果表明，SLE患者表現(xiàn)出免疫激活狀態(tài)，而VTE患者則表現(xiàn)出免疫抑制狀態(tài)。五個核心基因與SLE和VTE隊列中多種免疫細胞浸潤水平顯著相關（圖7C、D）。

圖7 SLE和VTE的免疫浸潤景觀

7. 浸潤免疫細胞與CG亞型之間的關聯(lián)

為了初步研究SLE和VTE中CGs與免疫浸潤的相關性，作者通過進行共識聚類分析分別確定了SLE和VTE中的CGs亞型。SLE的CGs亞型將GSE61635中的SLE患者分為C1和C2（圖8A-C）。VTE的CGs亞型將GSE19151中的VTE患者分為C1和C2（圖8D-F）。為了從細胞水平研究SLE和VTE不同CGs亞型之間的免疫特征多樣性，作者比較了MCPcounter的八個浸潤免疫細胞評分和CIBERSORT的27個浸潤免疫細胞百分比在C1和C2聚類之間的差異。結(jié)果表明，無論是SLE的CGs亞型還是VTE的CGs亞型，C1亞型的大多數(shù)免疫細胞群體浸潤水平較高。SLE的C1亞型表現(xiàn)出NK細胞、T細胞和CD8 T細胞的免疫浸潤（圖9A、B）。VTE的C1亞型顯示了T細胞、CD8 T細胞、中性粒細胞和NK細胞的免疫浸潤（圖9C、D）。GSVA算法被應用于計算富集分數(shù)，limma軟件包被用來識別不同亞型中明顯不同的通路。SLE亞型的C1具有較高的免疫活化（免疫應答的活化，T和B細胞參與的免疫應答的活化，髓系白細胞介導的免疫等），相比之下，C2亞型較低（圖9E）。VTE亞型的C1也具有較高的免疫活化（B細胞介導的免疫，免疫球蛋白的體細胞多樣性，淋巴細胞介導的免疫調(diào)節(jié)，白細胞介導的免疫的正調(diào)節(jié)，B細胞參與的免疫應答的活化等），相比之下，C2亞型較低（圖9F）。綜上所述，共識聚類進一步展示了免疫浸潤景觀與CGs之間的潛在相互關聯(lián)。在SLE和VTE中，C1聚類可以被視為免疫亞型，而C2聚類可以被視為非免疫亞型。

圖8 共識聚類

圖9 兩種CG亞型與免疫細胞浸潤的相關性

總結(jié)

作者確定了三個串擾基因（FPR2、RSAD2和HSP90AB1）作為有前景的診斷生物標志物，并分別基于它們構(gòu)建了SLE和VTE風險模型。免疫浸潤分析顯示了CGs和免疫細胞之間的密切相關性。免疫反應可能在SLE和VTE之間的關聯(lián)中起著重要作用。此外，作者基于CGs提出了兩種新的SLE和VTE患者的分子分類，包括免疫和非免疫亞型。

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標簽：知識