原代細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大,就必須進(jìn)行傳代(再培養(yǎng))。傳代培養(yǎng)也是種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也利培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。那么原代細(xì)胞如何進(jìn)行傳代培養(yǎng)及在過(guò)程中應(yīng)注意哪些事項(xiàng)?

傳代培養(yǎng)的過(guò)程

1、組織塊培養(yǎng)物的傳代過(guò)程基本操作過(guò)程

1) 將原代培養(yǎng)物連同底物蓋玻片一同取出，置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿上。

2) 用刀將培養(yǎng)物分割，刮去多余的部分，剩余繼續(xù)培養(yǎng)的部分。一般是分割刮去組織塊外圍的部分組織，留下中央的部分組織繼續(xù)培養(yǎng)。或部分分割并挑去組織塊，留下遷移出來(lái)的細(xì)胞于底物蓋玻片上繼續(xù)培養(yǎng)。也可以將組織塊挑出，再種植于新的底物蓋玻片上繼續(xù)培養(yǎng)。

3) 給剩余的培養(yǎng)物加上培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2、分離細(xì)胞培養(yǎng)物—貼壁型細(xì)胞的傳代過(guò)程：有兩項(xiàng)核心工作：一是分割培養(yǎng)物，二是再接種

基本操作過(guò)程

1) 取出培養(yǎng)瓶，打開瓶蓋，用吸管吸出舊的培養(yǎng)液。

2) 用無(wú) Ca2+ 、Mg 2+ 的平衡鹽溶液輕輕漂洗培養(yǎng)物1 次到 2 次，洗去殘余血清后棄去平衡鹽溶液。

3) 在培養(yǎng)皿內(nèi)加入胰蛋白酶溶液， 室溫下消化 5min 到 15min 顯微鏡下觀察細(xì)胞突起縮回近似圓形、細(xì)胞之間的間隙增大時(shí)停止消化。

4) 吸管吸去消化液后立即加入含血清培養(yǎng)液或蛋白酶抑制劑，抑制胰蛋白酶的活性，使消化終止。

5) 用彎頭吸管吸取培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶皿底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶皿底壁。

6) 低速離心，棄去上清液。

7) 用新鮮培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。

8) 根據(jù)傳代目的將細(xì)胞懸浮液接種到一個(gè)或多個(gè)新的培養(yǎng)器皿中。

3、分離細(xì)胞培養(yǎng)物—懸浮型細(xì)胞的傳代過(guò)程

基本操作過(guò)程

1) 將培養(yǎng)物移入離心管低速離心。根據(jù)傳代目的將細(xì)胞懸液接種在一個(gè)或多個(gè)新的培養(yǎng)皿中。

2) 用吸管吸去上清液，加入新鮮培養(yǎng)液使細(xì)胞沉淀重新懸浮

3) 根據(jù)傳代目的將細(xì)胞懸液接種在一個(gè)或多個(gè)新的培養(yǎng)皿中。

4) 加足培養(yǎng)液，加蓋封口，加入恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)

1)離體培養(yǎng)的細(xì)胞生命力比較脆弱，因此傳代時(shí)細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶底壁面積的 80%以前，不要急于傳代。

2)首次傳代，由于原代培養(yǎng)中各種類型的細(xì)胞?；祀s生長(zhǎng)，傳代時(shí)不同細(xì)胞又不同的消化時(shí)間，因而要根據(jù)需要注意及時(shí)處理。

3)對(duì)貼壁細(xì)胞消化后的吹打過(guò)程要有序進(jìn)行，要從一邊開始到另一邊結(jié)束，尤其是器皿的四角處， 確保瓶皿底壁各處的細(xì)胞都被吹打脫離。 吹打時(shí)動(dòng)作不宜過(guò)猛， 吹出液體的力度要適中，否則會(huì)直接損傷細(xì)胞并產(chǎn)生能傷害細(xì)胞的氣泡。

4)對(duì)于貼壁能力較弱，容易脫壁的細(xì)胞，可以不經(jīng)蛋白酶原消化處理和終止消化這兩步，直接對(duì)原代培養(yǎng)物或經(jīng)漂洗后用吸管進(jìn)行吹打使細(xì)胞脫離瓶皿底壁。 這種直接吹大的方法對(duì)生命力旺盛的細(xì)胞如某些腫瘤細(xì)胞較為合適。 高強(qiáng)度機(jī)械吹打易對(duì)細(xì)胞造成傷害較大， 細(xì)胞也常有較大數(shù)量的丟失， 因而絕大部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞需消化后才能吹打， 一般不單獨(dú)采用高強(qiáng)度機(jī)械吹打。

5)首次傳代時(shí)適當(dāng)增大接種的細(xì)胞密度，使培養(yǎng)的細(xì)胞間盡快發(fā)生相互作用，有利于傳代細(xì)胞的存活。

6)傳代數(shù)是指對(duì)培養(yǎng)物傳代的次數(shù)，它不等于細(xì)胞分裂的次數(shù)或細(xì)胞的代數(shù)，而僅代表傳代操作的次數(shù)。

7)傳代對(duì)細(xì)胞的影響或傷害程度僅次于將活細(xì)胞從生物體內(nèi)取出并進(jìn)行原代培養(yǎng)的程度。只是因?yàn)閭鞔蟮募?xì)胞生長(zhǎng)并不像剛開始原代培養(yǎng)時(shí)那樣緩慢罷了。

8)每經(jīng)過(guò)一次傳代，細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境就相應(yīng)發(fā)生一次較大變化。體外生長(zhǎng)的細(xì)胞若處于動(dòng)蕩的生活環(huán)境中， 細(xì)胞的遺傳特性往往容易發(fā)生改變。 經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)的細(xì)胞， 往往容易轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞。 因此， 傳代對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和性狀會(huì)產(chǎn)生不利影響， 一般情況下要盡可能減少傳代次數(shù)。

無(wú)菌操作注意事項(xiàng)

1)操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。

2)點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過(guò)營(yíng)養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。

3)操作動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。

4)不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺(tái)面上用品要布局合理。

5)瓶子開口后要盡量保持45"C斜位。

6)吸溶液的吸管等不能混用。