來自英國牛津大學(xué)、瑞典皇家理工學(xué)院等的研究團隊，基于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)來推斷良性和惡性組織的空間拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs），揭示了腫瘤內(nèi)與附近良性組織不同的克隆模型，并發(fā)現(xiàn)組織學(xué)良性組織的基因組不穩(wěn)定性，這可能代表了癌癥進化的早期事件。該文章在2022年8月發(fā)表于Nature，以下是文章的詳細解讀。

文章題目：Spatially Resolved Clonal Copy Number Alterations in Benign and Malignant Tissue

發(fā)表時間：2022-08-10

發(fā)表期刊：Nature

主要研究團隊：英國牛津大學(xué)、瑞典皇家理工學(xué)院等

影響因子：69.504

DOI：10.1038/s41586-022-05023-2

研究背景

癌癥組織通常發(fā)生了一系列的體細胞突變，明確良性組織向惡性組織的體細胞突變有助于提高腫瘤的早期診斷。然而，不同于生殖系的突變，體細胞突變只存在于一小部分細胞中。為了獲得這些罕見的不可遺傳突變的空間信息，絕大多數(shù)研究通過激光捕獲顯微切割來探索組織學(xué)或生物學(xué)標志定義的組織區(qū)域的突變狀態(tài)，甚至是單細胞精度的突變。但這些研究的組織切片只能收集和檢測有限數(shù)量的空間區(qū)域或單個細胞，從而使得相應(yīng)的研究存在固有的偏差。目前空間轉(zhuǎn)錄組已經(jīng)成為全基因組基因表達分析的有利工具，其可以無偏倚地探索組織的基因組信息。因此，在不受組織學(xué)邊界限制的情況下進行空間基因組分析，可以為描繪腫瘤與臨近良性組織的克隆結(jié)構(gòu)提供重要見解。

研究策略

該研究涉及到前列腺、腦、淋巴結(jié)、乳腺、皮膚等多個器官的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共120,000多個區(qū)域（圖1）。通過聚焦于前列腺腫瘤組織與臨近的良性組織的空間轉(zhuǎn)錄組，研究人員推斷每個區(qū)域的拷貝數(shù)狀態(tài)，描繪了前列腺組織的全器官克隆圖譜，并解析克隆亞型與組織學(xué)分型的關(guān)系。此外，研究人員利用拷貝數(shù)變異進一步構(gòu)建腫瘤克隆進化樹，展示了空間層面的腫瘤發(fā)展。最后，研究人員通過多個器官的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗證前列腺組織的結(jié)果，并剖析多組織間的克隆異質(zhì)性。

研究成果

1. 拷貝數(shù)變異及其克隆進化結(jié)果的驗證

為了驗證通過inferCNV推斷的拷貝數(shù)及根據(jù)其構(gòu)建的克隆進化樹是否準確，研究人員對具有DNA與RNA的單細胞數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果表明，使用inferCNV推斷的CNVs可以反映基于DNA的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，并且相應(yīng)的克隆進化樹與先前發(fā)表的結(jié)果相似（圖2）。為了測試在空間數(shù)據(jù)中能否實現(xiàn)相應(yīng)的拷貝數(shù)推斷，研究人員開發(fā)了一個算法，從而模擬生成具有不同CNVs的組織及相應(yīng)的空間數(shù)據(jù)。在模擬的數(shù)據(jù)中使用空間推斷的CNV（siCNV）成功再現(xiàn)了拷貝數(shù)狀態(tài)和克隆亞型，表明通過空間轉(zhuǎn)錄組能夠?qū)崿F(xiàn)空間層面的拷貝數(shù)推斷并進行克隆進化分析。

2.?前列腺全器官的克隆景觀

使用整個前列腺器官的橫截面來探索常見惡性腫瘤的空間拷貝數(shù)狀態(tài)。根據(jù)H&E染色和Gleason分級注釋每個spot的組織學(xué)狀態(tài)（圖3a），而通過兩個病理學(xué)家的手動注釋可以對每個spot的病理狀態(tài)進行評估（圖3e，紅圈表示含有50%的癌細胞，白圈表示含有50%的良性上皮細胞，黑圈表示單一細胞類型的比例小于50%）?；虮磉_的因子分析顯示，組織學(xué)與基于marker基因注釋的腫瘤、增生和良性上皮因子之間的重疊（圖3b、3e）。同樣，基于推測的拷貝數(shù)可發(fā)現(xiàn)大部分的組織區(qū)域都是拷貝數(shù)中性的，而某些區(qū)域的CNV活性增加，如V1_1、H2_1、H1_1等（圖3c、3f）。這些初步結(jié)果表明，推斷的拷貝數(shù)狀態(tài)與相應(yīng)的組織學(xué)以及基因表達有所不同。

上述表明，某些注釋為組織學(xué)良性的區(qū)域顯示出CNV活性增加。因此，在后續(xù)推斷CNV時將注釋為組織學(xué)良性及缺乏CNV的spot作為參考集。CNV推斷結(jié)果顯示，相同Gleason分級的區(qū)域中存在不同的克隆亞型（圖4a、4d、4e）。為了構(gòu)建克隆樹，研究人員假設(shè)（1）包含相同拷貝數(shù)特征的細胞群更有可能是相關(guān)的，而非偶然產(chǎn)生；（2）體細胞拷貝數(shù)事件是隨著時間的推移依次獲得。由此，該研究構(gòu)建了一個系統(tǒng)發(fā)育樹來描述序列克隆事件（圖4a）。兩個克?。寺和B）缺乏關(guān)鍵的CNV事件，包括染色體16q和8p上的缺失，并且這兩個克隆亞型在空間上主要聚焦在H1_2切片上。而大多數(shù)的克隆亞型位于Gleason第4分級的病灶周圍（圖4a~4c），因此研究將重點聚焦于這個主要區(qū)域（跨越H1_4、H1_5和H2_5切片）。這個區(qū)域可以觀察到一個共同的祖先克?。寺），包括6q和16q染色體上的拷貝數(shù)損失，以及12q和16q染色體上的拷貝數(shù)增加。這個克隆亞型明顯位于主瘤灶內(nèi)側(cè)的Gleason第2分級區(qū)域（H1_4切片）和位于中上部邊緣并被病理學(xué)家描述為“過渡區(qū)域”的區(qū)域（H2_5切片）。不同空間位置保守的CNV特征是值得關(guān)注的，一個可能的解釋是克隆H代表前列腺癌克隆樹分支形態(tài)的線性序列，并發(fā)生了進一步的體細胞事件，產(chǎn)生了克隆I、J和K，并形成了一個高級別腫瘤病灶（圖4b）。

3.?跨越組織邊界的體細胞克隆

鑒于上述結(jié)果顯示細胞表型與推斷的基因型不一致，因此，研究人員分析了前列腺左側(cè)邊緣區(qū)內(nèi)含有大致相同比例癌癥和良性組織的H2_1切片所有spot的拷貝數(shù)狀態(tài)，并根據(jù)定義的聚類將該切片內(nèi)的spots劃分為克隆A至克隆G（圖5a~5b）。在空間上，推測的克隆亞型與組織學(xué)亞型廣泛相關(guān)，但仍有一些重要的區(qū)別（圖5c~5d）。例如，許多CNV已經(jīng)發(fā)生在良性組織中（克隆C），其中最明顯的是在8號和10號染色體，這包括致癌基因MYC的擴增和抑癌基因PTEN的缺失。且在空間上該克隆由一個完全良性的組織構(gòu)成，克隆樹顯示該區(qū)域從附近大部分拷貝數(shù)中性的克隆A和B分支出來。因而組織學(xué)良性的細胞存在體細胞突變事件，表明克隆亞群能夠跨越組織學(xué)邊界。

為了驗證這種推斷的拷貝數(shù)狀態(tài)是否真正代表了潛在的基因型，研究人員用FISH探針靶向兩個具有鑒別意義的特定基因，即MYC和PTEN。結(jié)果顯示，在正常的良性組織（克隆A）中這兩個基因是二倍體，而在改變的良性組織（克隆C）和腫瘤（克隆F）中，MYC擴增和PTEN缺失是明顯的（圖5e）。

鑒于上述結(jié)果，研究人員認為對推斷的低級別癌癥基因型的分析可能揭示與高級癌癥的重要差異，并依上結(jié)果提出一個假設(shè)：部分低級別腫瘤因缺乏關(guān)鍵的體細胞突變事件而不能發(fā)展為高級別的腫瘤。

4. 多個組織中的克隆異質(zhì)性

上述結(jié)果顯示，前列腺癌內(nèi)克隆的異質(zhì)性以及良性前列腺組織也存在體細胞突變事件。研究人員將這一結(jié)果推廣到多個器官中，以進一步驗證不同組織中可能的克隆異質(zhì)性，以及良性組織的體細胞突變事件。

首先，研究人員分析了一個良性淋巴結(jié)，可以觀察到整個組織切片拷貝數(shù)中性的狀態(tài)（圖6a~6b）。隨后，將良性鱗狀上皮和鱗狀細胞癌的皮膚組織納入分析。兩個關(guān)鍵的體細胞突變事件（染色體1號和12號部分區(qū)域擴增）在臨近的完全由組織學(xué)良性組成的區(qū)域出現(xiàn)（圖6c~6d），從而證實在其他癌癥類型中腫瘤克隆能夠突破組織邊界；進一步通過DNA FISH驗證了1q染色體擴增（CKS1B）、8q染色體缺失（MYC）和19q染色體缺失（EHD2）結(jié)果。同樣，研究人員對小兒髓母細胞瘤、導(dǎo)管乳腺癌以及成人膠質(zhì)母細胞瘤進行分析，發(fā)現(xiàn)小兒髓母細胞瘤的克隆類型均勻一致，但可以觀察到關(guān)鍵的體細胞突變事件，如3q擴增、9q缺失等（圖6e~6f）?？偟膩碚f，在五個分析的器官中，組織克隆的多樣性明顯不同，癌癥和良性組織的基因組從同質(zhì)性到高度異質(zhì)性不等（圖6g）。

?總? ?結(jié)?

本研究以前列腺癌為重點，借助空間轉(zhuǎn)錄組分析全器官的拷貝數(shù)狀態(tài)，表明組織學(xué)上良性和惡性區(qū)域間可能存在的分子關(guān)系，即良性組織內(nèi)可能出現(xiàn)惡性區(qū)域廣泛存在的體細胞突變事件，相應(yīng)的腫瘤克隆能跨越組織邊界?？傊?，本研究以一個無偏倚途徑來探索基因組完整性，為癌癥分子病理學(xué)的研究提供了思路，同時也為改善臨床重要癌癥的早期檢測、靶向和全身治療，以及改善惡性腫瘤患者的預(yù)后提供了基礎(chǔ)。