酵母是被歸類為真菌界成員的真核單細(xì)胞微生物。第一種酵母起源于數(shù)億年前，目前已鑒定出1,500種。據(jù)估計(jì)它們占所有描述的真菌種類的1％。大多數(shù)酵母通過(guò)有絲分裂無(wú)性繁殖，也有許多通過(guò)不對(duì)稱分裂過(guò)程（即出芽）進(jìn)行繁殖。通過(guò)發(fā)酵，酵母物種釀酒酵母將碳水化合物轉(zhuǎn)化為二氧化碳和酒精。啤酒，葡萄酒和面包的歷史與酵母發(fā)酵有關(guān)。它也是近代的細(xì)胞學(xué)，原代細(xì)胞研究的過(guò)程中最重要的模型生物，并且是研究最深入的真核微生物之一。研究人員已經(jīng)使用它來(lái)收集有關(guān)真核細(xì)胞生物學(xué)以及最終人類生物學(xué)的信息。

用于可再生生物燃料和生化生產(chǎn)的非常規(guī)酵母的基因工程

解脂耶氏酵母是一種非致病性，二態(tài)性和嚴(yán)格需氧的酵母菌種。由于其獨(dú)特的生理特征和代謝特性，這種非常規(guī)酵母不僅是研究真菌分化的基本性質(zhì)的良好模型，而且還是生化生產(chǎn)和各種生物技術(shù)應(yīng)用的有希望的微生物平臺(tái)，需要廣泛的基因敲除技術(shù)。然而，解脂耶氏酵母的基因操作由于缺乏有效和穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以及非常高的非同源重組率而受到限制，這主要?dú)w因于KU70基因。研究人員報(bào)告了一種簡(jiǎn)便而快速的方案，用于解脂耶氏酵母Po1g中的有效遺傳轉(zhuǎn)化和基因缺失。首先，建立了將外源DNA有效轉(zhuǎn)化為解脂耶氏酵母Po1g的方案。其次，為了獲得用于進(jìn)一步刪除靶基因提高的雙交換同源重組率，通過(guò)轉(zhuǎn)化攜帶1kb同源臂的破壞盒來(lái)刪除KU70基因。第三，為了證明在刪除KU70基因后提高的基因刪除效率，研究人員在KU70敲除平臺(tái)菌株上使用相同的程序分別刪除了11個(gè)編碼醇脫氫酶和醇氧化酶的靶基因。觀察到，精確同源重組的比率從缺失Po1g中的KU70基因的小于0.5％顯著增加到針對(duì)Po1gKU70Δ中的11個(gè)靶基因的單基因缺失的33％-71％。構(gòu)建攜帶潮霉素B抗性標(biāo)記和Cre/LoxP系統(tǒng)的復(fù)制質(zhì)粒，并通過(guò)表達(dá)Cre重組酶最終去除酵母敲除菌株中的選擇標(biāo)記基因，以促進(jìn)多輪靶向遺傳操作。所得的單基因缺失突變體在生物燃料和生物化學(xué)的生產(chǎn)中具有潛在的應(yīng)用。

RNA引導(dǎo)的Cas9在酵母基因組中的組合代謝途徑組裝

釀酒酵母是生產(chǎn)谷物和纖維素乙醇，異丁醇，丁二醇，類異戊二烯和其他化學(xué)品的重要工業(yè)平臺(tái)。成功生產(chǎn)菌株的構(gòu)建通常涉及多個(gè)基因敲除和表達(dá)盒的染色體整合，以重定向代謝通量，以將糖和其他原料轉(zhuǎn)化為所需產(chǎn)品?；赗NA指導(dǎo)的Cas9基因組編輯已在包括釀酒酵母在內(nèi)的許多原核和真核宿主中得到證實(shí)，在其中它們還被用作代謝工程的工具。為了擴(kuò)展RNA引導(dǎo)的Cas9作為代謝途徑構(gòu)建工具的利用，研究人員展示了多達(dá)17個(gè)重疊的編碼β-胡蘿卜素生物合成途徑的DNA片段的直接組裝和染色體整合。此外，研究人員為β-胡蘿卜素生物合成途徑生成了組合菌株文庫(kù)，直接整合到酵母基因組中以創(chuàng)建多樣化的菌株文庫(kù)。這樣就可以在穩(wěn)定的染色體整合菌株中篩選組合文庫(kù)，以快速提高產(chǎn)品滴度。這種途徑組裝的組合方法將大大加快目前S代謝工程的速度。釀酒酵母作為工業(yè)平臺(tái)，并增加了可以同時(shí)進(jìn)行酶篩選，表達(dá)優(yōu)化和蛋白質(zhì)工程評(píng)估的菌株數(shù)量，以實(shí)現(xiàn)新型工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)品商業(yè)化所需的滴度，速率和產(chǎn)量。

開發(fā)用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的擬南芥酵母Rhodosporidium Toruloides基因組編輯

已研究了擔(dān)子菌酵母圓核假單胞菌（R. toruloides）作為生產(chǎn)脂質(zhì)和類胡蘿卜素的有希望的宿主。然而，由于缺乏有效的遺傳工具，對(duì)該酵母進(jìn)行合理的操作仍然很困難。描述了簇狀規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR/Cas9）系統(tǒng)的開發(fā)，用于在擬南芥中進(jìn)行基因組編輯。首先，通過(guò)將含有密碼子優(yōu)化的Cas9基因的盒整合到基因組中，產(chǎn)生具有足夠產(chǎn)量的金黃色葡萄球菌?Cas9蛋白的擬南芥菌株。同時(shí)，鑒定了兩個(gè)U6基因，預(yù)測(cè)了兩個(gè)U6啟動(dòng)子，并確認(rèn)了具有U6b啟動(dòng)子的單向?qū)NA（sgRNA）的轉(zhuǎn)錄更好。接下來(lái)，設(shè)計(jì)分別針對(duì)CRTI，CAR2和CLYBL基因的sgRNA盒，將其轉(zhuǎn)化為表達(dá)Cas9的菌株，并發(fā)現(xiàn)成功插入和缺失（indel）突變的轉(zhuǎn)化子超過(guò)60％。此外，當(dāng)sgRNA盒包含側(cè)翼為基因CRTI的兩個(gè)同源臂的供體DNA時(shí)，基因敲除會(huì)通過(guò)同源重組發(fā)生。因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)現(xiàn)在已被建立為魯氏擬南芥中強(qiáng)大的基因組編輯工具，這應(yīng)有助于功能基因組研究和先進(jìn)的細(xì)胞工廠發(fā)展。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢(shì)，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡(jiǎn)單，通過(guò)瞬時(shí)基因表達(dá)可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細(xì)胞敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對(duì)GLUL基因組位點(diǎn)進(jìn)行靶向測(cè)序，產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制。

根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計(jì)。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個(gè)基因的編碼序列敲除，達(dá)到大片段敲除的效果。

Reference

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EauClaire, Steve, Zhang, et al. Combinatorial metabolic pathway assembly in the yeast genome with RNA-guided Cas9.[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2016.

Xiang, Jiao, Yue,et al. Developing a CRISPR/Cas9 system for genome editing in the basidiomycetous yeast Rhodosporidium toruloides.[J]. Biotechnology Journal, 2019.

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