前言

頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）是一種常見的癌癥，其發(fā)病率及死亡率高，預后差?；陧樸K的化療方案是目前治療局部晚期/轉移性HNSCC重要的輔助治療方法之一，這對提高患者的生存率至關重要。然而，固有的和獲得性的順鉑耐藥可直接導致患者治療失敗、復發(fā)甚至死亡。因此，對順鉑耐藥機制的深入研究，探索逆轉耐藥和提高臨床療效的潛在靶點具有重要的臨床意義。

7 月 1 日，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院張建軍研究員和馬海龍博士作為共同通訊作者， 在BMC Medicine（IF: 11.150）雜志發(fā)表了題為的研究論文，研究首次闡明了調(diào)控HNSCC產(chǎn)生順鉑耐藥的關鍵信號通路：CREB5-TOP1MT-線粒體，這為開發(fā)克服順鉑耐藥的潛在靶點和有效策略提供了全新的依據(jù)。

研究內(nèi)容

本研究目的是探討CREB5是否參與順鉑耐藥及其潛在的分子機制。在本研究中，研究者發(fā)現(xiàn)CREB5通過轉錄激活TOP1MT來調(diào)節(jié)線粒體凋亡，從而參與HNSCC順鉑耐藥。最新發(fā)現(xiàn)的CREB5/TOP1MT信號軸為HNSCC的順鉑耐藥提供了一個新的靶點，對克服耐藥和提高臨床療效具有重要意義。

研究路線

研究結果

1、CREB5在順鉑耐藥的HNSCC（CR-HNSCC）細胞中高表達，并促進順鉑耐藥

首先，研究者使用表達譜芯片檢測順鉑耐藥CR-HNSCC細胞中的差異基因，在兩種順鉑耐藥細胞中均有241 個基因表達上調(diào)，交集基因顯著富集于PI3K-AKT信號通路（圖 1A-C）。值得注意的是，在PI3K-AKT信號通路中，CR-HNSCC細胞中CREB5的表達差異最大，且在細胞中以順鉑濃度依賴的方式高表達（圖 1F-I）。同時，順鉑治療可呈劑量和時間依賴的顯著誘導AKT在Ser473位點的磷酸化（圖 1D-E），磷酸化的AKT表達上調(diào)，CREB5的核易位增加（圖 1J）。以上數(shù)據(jù)表明，轉錄因子CREB5受AKT磷酸化調(diào)控，然后易位到細胞核中。

為了進一步研究CREB5表達與HNSCC順鉑耐藥之間的相關性，qPCR檢測驗證CR-HNSCC樣本中CREB5表達上調(diào)（圖 1K）。COX回歸分析顯示，CREB5的高表達顯著降低HNSCC患者的總生存率（圖 1L）。體外細胞實驗表明過表達CREB5顯著提高細胞中順鉑半抑制濃度，體內(nèi)模型驗證過表達CREB5可促進腫瘤生長，導致腫瘤重量增加（圖 1M-S）。綜上結果，表明CREB5可促進HNSCC的順鉑耐藥。

圖1 | CREB5在順鉑耐藥的HNSCC細胞中表達上調(diào)，并促進順鉑耐藥

2、CREB5促進HNSCC增殖，抑制線粒體凋亡

研究者接下來評估了CREB5是否影響細胞增殖、集落形成和細胞凋亡。首先，發(fā)現(xiàn)CREB5可以增強HNSCC細胞的增殖和集落形成能力（圖 2A-D）。其次，通過流式細胞術進行細胞凋亡檢測，發(fā)現(xiàn)順鉑誘導CREB5過表達組的HNSCC細胞凋亡率顯著降低（圖 2E-F）。最后為了探討其作用機制，檢測了線粒體凋亡相關蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)過表達CREB5可以促進Bcl-2和Bcl-xL的表達，抑制Bax的表達和細胞色素c的釋放，從而抑制細胞凋亡的線粒體通路（圖 2G-H）。因此，過表達CREB5促進HNSCC腫瘤進展，抑制HNSCC線粒體凋亡。

圖2 | CREB5調(diào)控親本和順鉑耐藥細胞的線粒體凋亡

3、CREB5促進靶基因TOP1MT的轉錄

為了探究CREB5的下游基因，通過qPCR發(fā)現(xiàn)過表達CREB5后，HNSCC細胞中TOP1MT持續(xù)上調(diào)，WB實驗也驗證這一結果（圖 3A-D）。同時在順鉑耐藥的HNSCC樣本中，CREB5和TOP1MT的表達呈正相關（圖 3E）。此外，過表達TOP1MT促進抗凋亡蛋白的表達，抑制促凋亡蛋白的表達（圖 3F-G）。這些結果表明，TOP1MT在調(diào)節(jié)線粒體凋亡通路的激活中具有重要作用。

隨后作者推測CREB5可能促進TOP1MT的轉錄，ChIP-PCR結果顯示，基于CREB5在TOP1MT啟動子區(qū)域的轉錄因子結合基序設計的引物，能在CR-HNSCC細胞中擴增TOP1MT啟動子片段（圖 3H）。通過雙熒光素酶檢測顯示，在CR-HNSCC中，缺失-253bp至-257bp可降低TOP1MT啟動子活性（圖 3I-K）。綜上所述，參與線粒體凋亡的TOP1MT是順鉑耐藥細胞中CREB5的一個新的轉錄靶點。

圖3 | CREB5促進HNSCC中TOP1MT的轉錄

4、CREB5通過HNSCC中的TOP1MT調(diào)節(jié)線粒體活性

為了探討TOP1MT在CREB5調(diào)節(jié)線粒體活性中的作用，作者發(fā)現(xiàn)過表達CREB5和TOP1MT均可促進細胞氧化磷酸化的發(fā)生過程，同時，基礎呼吸、ATP產(chǎn)生、最大呼吸和呼吸容量均增加（圖 4A-D）。沉默CREB5抑制了線粒體活性，而過表達TOP1MT在順鉑耐藥細胞中逆轉了這一結果（圖 4E-J）。

這些結果表明，CREB5和TOP1MT均增強了線粒體活性。過表達CREB5通過增加Bcl-2 和Bcl-xL，降低Bax、細胞色素c、裂解半胱天冬酶和PARP來抑制線粒體凋亡，TOP1MT敲除逆轉這一結果（圖 4K-L）。這些結果證明，在順鉑耐藥細胞中，CREB5通過TOP1MT調(diào)控線粒體凋亡。

圖4 | CREB5通過TOP1MT調(diào)節(jié)線粒體活性

5、CREB5通過HNSCC中的TOP1MT對順鉑產(chǎn)生耐藥性

根據(jù)以上發(fā)現(xiàn)，CREB5通過TOP1MT調(diào)控線粒體凋亡，作者推測CREB5可能通過HNSCC中TOP1MT對順鉑產(chǎn)生耐藥。流式細胞術和半抑制濃度檢測（IC50）顯示，過表達CREB5降低了凋亡細胞百分比，提高了順鉑IC50，而沉默TOP1MT增加了細胞凋亡，降低了順鉑IC50（圖 5A-D）。在耐藥細胞系中也有相似結果（圖 5E-H）。上述結果表明，CREB5通過TOP1MT調(diào)控凋亡介導HNSCC對順鉑耐藥。

圖5 | CREB5通過TOP1MT抑制HNSCC細胞的凋亡，促進對順鉑的耐藥性

6、CREB5和TOP1MT的雙靶向克服了順鉑耐藥

為了確定CREB5和TOP1MT的雙靶向沉默是否克服了HNSCC的順鉑耐藥，作者建立了耐藥異種移植小鼠模型，結果顯示雙靶向沉默組（siCREB5&siTOP1MT）對腫瘤重量和腫瘤生長速率的抑制作用最為明顯（圖 6A-B）。此外，TOP1MT和CREB5的雙靶向沉默可顯著降低Ki67的陽性率（圖 6C）。

采用RT-PCR和免疫印跡法檢測腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)TOP1MT和CREB5的mRNA和蛋白水平明顯受到抑制（圖 6D-E）。為了評估siCREB5和siTOP1MT在HNSCC體內(nèi)的治療價值，構建了含有順鉑耐藥患者樣本的異種移植模型，結果顯示siCREB5和siTOP1MT在體內(nèi)顯著抑制了腫瘤的生長（圖 6F-J）。這些結果表明，CREB5和TOP1MT的雙靶向作用對克服HNSCC的順鉑耐藥有顯著作用。

圖6 | CREB5和TOP1MT雙靶向?qū)樸K耐藥HNSCC有強大的抗腫瘤作用

7、CREB5與HNSCC患者中TOP1MT的表達呈正相關

為了進一步探討CREB5和TOP1MT的相關性，免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的CREB5和TOP1MT均顯著高于正常對照組，且CREB5的表達與TOP1MT呈正相關（圖 7A-D）。分析蛋白表達與臨床特征的相關性，也發(fā)現(xiàn)CREB5和TOP1MT高表達與腫瘤淋巴結轉移（TNM）晚期相關（圖 7E-H）。

圖7 | 在HNSCC組織中CREB5與TOP1MT的表達呈正相關

研究結論

本研究表明，鉑類藥物通過誘導AKT磷酸化，促進CAMP反應元件結合蛋白5（CREB5）發(fā)生核易位，并轉錄激活線粒體DNA拓撲異構酶TOP1MT，隨后通過上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax蛋白的水平抑制線粒體凋亡，最終導致HNSCC發(fā)生化療耐藥。研究結果揭示了一種HNSCC發(fā)生化療耐藥的全新機制：CREB5-TOP1MT-線粒體調(diào)控軸，這為開發(fā)與制定克服順鉑耐藥的潛在靶點和有效策略提供了新的基礎。

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院21級碩士童桐和秦星博士為論文的共同第一作者，歐易生物在本項目中承擔了表達譜芯片檢測及分析工作。文中特別致謝歐易生物總監(jiān)祖啟東，為該項目提供數(shù)據(jù)分析服務。

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