直播回顧｜基因編輯敲入細(xì)胞模型構(gòu)建的挑戰(zhàn)和解決方案問答集錦
賽業(yè)生物細(xì)胞基因編輯生產(chǎn)經(jīng)理范麗莉為大家?guī)砹?strong>「基因編輯敲入細(xì)胞模型構(gòu)建的挑戰(zhàn)和解決方案」線上課程，在最后的答疑環(huán)節(jié)，大家提出了許多困擾已久的問題，就讓云課堂小助理帶大家一起回顧一下這些精彩問答吧！
Q：請問基因敲入相比起基因敲除的難點(diǎn)在哪里？
A：
原理：CRISPR-Cas9基因編輯利用Cas9和sgRNA切割基因組形成DSB，哺乳動物細(xì)胞主要利用NHEJ和HDR兩條保守途徑修復(fù)DSB。這兩條修復(fù)途徑相互競爭，大部分DSB通常由NHEJ修復(fù)。而基因敲除通過NHEJ通路，基因敲入通過HDR通路。從機(jī)制上來說，基因敲入比基因敲除更加困難。
方案設(shè)計：基因敲入需要確保外源基因準(zhǔn)確地插入目標(biāo)位點(diǎn)，需要精確的設(shè)計gRNA和donor，而基因敲除的gRNA可選擇的范圍就比較廣。
遞送策略：基因敲入需要將gRNA，Cas9和donor都遞送到細(xì)胞內(nèi)，需要選擇更優(yōu)的遞送策略才能獲得更高的效率。
克隆篩選和鑒定：由于基因敲入的效率普遍較低，挑取的克隆數(shù)相對較多，鑒定的工作量也會相應(yīng)增加。
Q：α-donor提升HDR的原理是什么？
A：
關(guān)于α-donor提升HDR，我們主要從以下3個方面做了改進(jìn)和優(yōu)化：
優(yōu)化同源臂設(shè)計，選擇最優(yōu)的gRNA和Donor序列；
優(yōu)化遞送策略；
優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法。
Q：腫瘤細(xì)胞和IPSC細(xì)胞構(gòu)建的細(xì)胞模型和小鼠模型，主要不同點(diǎn)是什么？
A：
腫瘤細(xì)胞模型操作簡便，構(gòu)建成本低，周期短，可進(jìn)行高通量篩選，具有人類遺傳背景，能很好地模擬疾病模型。缺點(diǎn)是無法模擬動物的生理環(huán)境。
IPSC細(xì)胞模型細(xì)胞除了具有無限增殖能力，高通量篩選和人類的遺傳背景，還具有產(chǎn)生各種類型細(xì)胞的能力。對于研究稀少或難以分離的細(xì)胞類型（例如神經(jīng)元或心肌細(xì)胞），可通過重編程技術(shù)將成體細(xì)胞（常用外周血）重編程獲得IPSC細(xì)胞，進(jìn)行相應(yīng)的基因編輯，再分化成特定的細(xì)胞來作為疾病模型。對于突變較多的疾病類型，可選擇從病人身上抽血重編程成IPSC細(xì)胞再分化成特定的細(xì)胞或者類器官，這樣的疾病模型就擁有了病人身上的所有突變，能更好地模擬該種疾病。這一點(diǎn)無論是腫瘤細(xì)胞還是動物都比較難實現(xiàn)的。其缺點(diǎn)也是無法模擬動物的生理環(huán)境。
動物模型能夠模擬環(huán)境效應(yīng)和個體在生命周期內(nèi)的反應(yīng)，研究體內(nèi)系統(tǒng)的相互作用、細(xì)胞類型、組織和整個動物系統(tǒng)之間的相互作用。但動物模型構(gòu)建周期長，無法高通量篩選。遺傳背景與人類不同，在代謝、免疫系統(tǒng)、行為學(xué)方面存在差異。動物與人的各方面差異使得篩選藥物在臨床轉(zhuǎn)化方面存在極大挑戰(zhàn)。
Q：出現(xiàn)可變剪切需要重新設(shè)計SgRNA嗎？出現(xiàn)這種情況怎么處理？
A：
出現(xiàn)可變剪切不一定需要重新設(shè)計設(shè)計gRNA。如果有如下的選擇可以不用重新設(shè)計gRNA。
篩選到的陽性克隆>1且有不同突變類型的克隆，可以選擇其他突變類型克隆來避免可變剪切；
gRNA設(shè)計在不同外顯子上，可通過選擇不同外顯子上面的單克隆來避免出現(xiàn)可變剪切的問題。
Q：請老師介紹一下HepG2細(xì)胞挑克隆法？
A：
HepG2細(xì)胞挑克隆法需要先將細(xì)胞稀釋到非常低的密度種到培養(yǎng)皿里，培養(yǎng)一定時間，根據(jù)克隆團(tuán)形成情況挑取合適的克隆團(tuán)到96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。
Q：怎么構(gòu)建IPSC的基因敲入和敲除細(xì)胞？
A：
構(gòu)建IPSC的基因敲入目前還是比較困難的，技術(shù)壁壘和對平臺的要求都比較高。如何構(gòu)建IPSC的基因敲入和敲除細(xì)胞，需要注意以下幾個細(xì)節(jié)：
培養(yǎng)條件苛刻，編輯過程容易分化，失去干性，合適培養(yǎng)的條件及豐富的細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗至關(guān)重要；
選擇最優(yōu)的基因敲入和敲除方案設(shè)計；
IPSC細(xì)胞對轉(zhuǎn)染較敏感，需要摸索適合的轉(zhuǎn)染方案確保高轉(zhuǎn)染效率和活率；
IPSC細(xì)胞易成團(tuán)生長，分成單個細(xì)胞比較難生長，需要摸索出適合的單克隆制備方法和條件。
