間質(zhì)基質(zhì)/干細(xì)胞（MSCs）是一種多能細(xì)胞群，是治療急性和慢性肝臟疾病最具有應(yīng)用前景的選擇之一，并已逐漸進(jìn)入臨床實(shí)踐。由于MSC在不利環(huán)境中的滯留性差，目前依然存在植入損傷組織后細(xì)胞損失或治療效果不佳等問題。調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡（RCD）的多種形式，如壞死、焦亡、鐵死亡等均被認(rèn)為與MSC的病理應(yīng)激相關(guān)，然而導(dǎo)致MSC在肝臟環(huán)境中過度損失的具體RCD形式依然不清楚。近日，空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院張富洋/陶凌教授研究團(tuán)隊(duì)在Advanced Science（IF=17.521）上發(fā)表了名為“Suppressing Mesenchymal Stromal Cell Ferroptosis Via Targeting a Metabolism-Epigenetics Axis Corrects their Poor Retention and Insufficient Healing Benefits in the Injured Liver Milieu”的研究論文，旨在探討何種形式的RCD導(dǎo)致MSCs在植入受損肝臟早期或ROS刺激下死亡，并探討了優(yōu)化間充質(zhì)干細(xì)胞治療的基本機(jī)制和臨床前策略。值得注意的是，該文章使用漢恒生物腺病毒在MSCs中過表達(dá)Bcat1、Gpx4以及沉默Bcat、Egr1等基因。

首先，作者在脂肪衍生間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）中加入過氧化氫（H2O2）模擬受損肝臟中的ROS風(fēng)暴，發(fā)現(xiàn)ADSCs存活率顯著下降；H2O2刺激6小時(shí)后的細(xì)胞顯示出線粒體萎縮、嵴消失、線粒體膜破裂等鐵死亡超微結(jié)構(gòu)特征，以及Fe2+在ADSCs的線粒體中明顯累積。使用鐵死亡相關(guān)RCD抑制劑Fer-1和Lip-1處理細(xì)胞后，顯著抑制了這些變化。作者在加入PBS、Fer-1和Lip-1的溶劑中將等量EGFP標(biāo)記的ADSCs遞送至肝臟，發(fā)現(xiàn)Fer-1和Lip-1提高了ADSCs的存活率。而ADSCs移植CCl4誘導(dǎo)肝損傷大鼠模型后的病理結(jié)果同樣顯示多數(shù)RCD抑制劑中，只有Fer-1和Lip-1提高了ADSCs的治療效果，包括肝臟壞死病變明顯減少、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少、血清ALT和AST水平降低。

圖1 過度鐵死亡導(dǎo)致植入受傷肝臟或ROS應(yīng)激后MSC迅速損失

為了探索驅(qū)動(dòng)MSC鐵死亡的機(jī)制，作者對(duì)Erastin（一種鐵質(zhì)化誘導(dǎo)劑）處理6小時(shí)的ADSCs進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，對(duì)差異前十的下調(diào)蛋白進(jìn)行相應(yīng)基因的siRNA篩選，結(jié)果顯示BCAT1的沉默顯著促進(jìn)Erastin誘導(dǎo)的ADSCs死亡。BCAT1為支鏈氨基酸（BCAA）分解代謝酶，將BCAA的氨基轉(zhuǎn)移至α-酮戊二酸（α-KG），其蛋白水平在Erastin和另一種鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3處理的ADSCs中均顯著下降。沉默BCAT1后，ADSCs對(duì)Erastin和RSL3呈現(xiàn)劑量依賴性死亡，鐵死亡核心過程脂質(zhì)過氧化進(jìn)一步增加，而Fer-1可抑制這種細(xì)胞死亡和脂質(zhì)過氧化的加劇。

圖2 BCAT1下調(diào)使MSC對(duì)鐵死亡敏感

接下來，作者將感染了shBact1或shNC腺病毒的ADSCs移植至肝臟損傷大鼠，探究BCAT1下調(diào)引起的鐵死亡易感性是否會(huì)影響MSC植入受損肝臟時(shí)的存活和治療效果。BCAT1沉默明顯抑制了ADSCs在受傷肝臟環(huán)境中的存活，ADSCs對(duì)肝臟壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、促炎癥細(xì)胞因子的緩解作用。而Fer-1聯(lián)合處理則可抑制對(duì)照組和BCAT1沉默所帶來的負(fù)面作用。

圖3 BCAT1下調(diào)限制了MSC在受傷肝臟中的存活和治療效果

隨后，作者探討了BCAT1對(duì)MSCs鐵死亡的調(diào)控機(jī)制。鐵死亡PCR陣列結(jié)果顯示沉默BCAT1的ADSCs在Erastin刺激后鐵死亡相關(guān)基因Gpx4、Hspb1和Hsf1的mRNA水平明顯下降，WB結(jié)果顯示GPX4蛋白存在顯著下調(diào)。隨后，使用過表達(dá)GPX4腺病毒處理ADSCs，作者發(fā)現(xiàn)GPX4的表達(dá)挽救了BCAT1沉默ADSCs的異常Erastin誘導(dǎo)性鐵死亡和脂質(zhì)過氧化。另一方面，BCAT1酶活性抑制劑加巴噴丁和ERG240顯著加劇ADSCs的Erastin劑量依賴性鐵死亡反應(yīng)，并抑制GPX4蛋白表達(dá)。DM-α-KG（一種細(xì)胞可滲透的α-KG的衍生物）以劑量依賴的方式增加了Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡，而D-2-HG（一種α-KG依賴性雙加氧酶的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑）挽救BCAT1沉默的ADSCs在Erastin誘導(dǎo)下的GPX4表達(dá)抑制和鐵死亡。

圖4 BCAT1下調(diào)通過增加細(xì)胞內(nèi)α-KG水平來抑制GPX4表達(dá)

基于以上研究，作者推測(cè)α-KG依賴的雙加氧酶調(diào)節(jié)的表觀遺傳變化可能與ADSCs的GPX4和鐵死亡相關(guān)。在分析Erastin處理的BCAT1沉默ADSCs的RNA-seq、免疫熒光和WB數(shù)據(jù)后，作者發(fā)現(xiàn)組蛋白3賴氨酸9三甲基化（H3K9me3）豐度存在顯著變化。D-2-HG則抑制了BCAT1沉默導(dǎo)致的ADSCs中與鐵死亡相關(guān)的H3K9me3蛋白表達(dá)量降低。KDM4A/4B（α-KG依賴性脫甲基酶）在Erastin誘導(dǎo)下被其特異性抑制劑NSC 636819所抑制，這顯著改善了NC和shBCAST1組的H3K9me3和GPX4下調(diào)。然而H3K9me3在Gpx4啟動(dòng)子區(qū)域的占有率無明顯改變，于是作者通過RNA-seq數(shù)據(jù)確定早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白-1（EGR1）為BCAT1沉默的ADSCs中唯一顯著變化的可調(diào)控Gpx4的轉(zhuǎn)錄因子。通過NSC 636819誘導(dǎo)抑制H3K9me3的丟失，明顯阻斷了ERG1蛋白表達(dá)在對(duì)照組和BCAT1沉默的ADSC中的上調(diào)。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)證實(shí)Egr1啟動(dòng)子區(qū)域的H3K9me3的占有率在BCAT1沉默后降低，而NSC 636819的共同處理則完全阻止這一抑制效果。EGR1的沉默顯著挽救了在Erastin存在時(shí)、BCAT1沉默導(dǎo)致的GPX4下調(diào)。

圖5 BCAT1通過代謝-表觀遺傳學(xué)協(xié)調(diào)機(jī)制調(diào)節(jié)GPX4轉(zhuǎn)錄

接下來，作者使用腺病毒介導(dǎo)的BCAT1過表達(dá)和GPX4沉默ADSCs探究了BCAT1過表達(dá)能否增強(qiáng)MSCs對(duì)鐵死亡的抵抗和治療效果。BCAT1的過表達(dá)明顯改善了在受傷肝臟環(huán)境中的存活率以及治療效果，而GPX4沉默則完全抑制了BCAT1過表達(dá)所帶來的壞死病變、血清ALT和AST水平、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、促炎癥細(xì)胞因子等方面的肝臟保護(hù)作用。

圖6 BCAT1過表達(dá)以GPX4依賴性方式增加MSC的存活和治療效果

最后，作者使用人類ADSCs測(cè)試了抑制鐵死亡的治療策略是否具有臨床轉(zhuǎn)化潛力。在hADSCs上觀察到H2O2或Erastin刺激所導(dǎo)致的分子變化與大鼠ADSCs相似，包括BCAT1、H3K9me3、GPX4下調(diào)、和ERG1上調(diào)。Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡和鐵死亡相關(guān)的脂質(zhì)過氧化在過表達(dá)BCAT1后明顯減弱，而GPX4沉默則抑制了BCAT1過表達(dá)所介導(dǎo)的這些抗鐵死亡作用。在肝損傷大鼠模型中同樣觀察到抑制hADSCs的鐵死亡過程顯著增加了植入肝臟后的存活率，并降低了壞死性病變和血清ALT和AST水平。

圖6 BCAT1過表達(dá)或鐵死亡抑制可增強(qiáng)人MSC在受損肝臟中的存活和治療效果

在本研究中，作者利用大鼠和人ADSCs進(jìn)行肝損傷大鼠模型移植和體外基因調(diào)控研究，揭示了MSC在植入受損肝臟后鐵死亡敏感性的代謝-表觀遺傳學(xué)機(jī)制：BCAT1作為調(diào)節(jié)MSC鐵死亡敏感性的關(guān)鍵分子，其表達(dá)下調(diào)通過α-KG的積累增強(qiáng)α-KG依賴的KDM4A/B活性，并減少EGR1啟動(dòng)子的H3K9me3修飾，這導(dǎo)致EGR1的快速上調(diào)并抑制了GPX4的轉(zhuǎn)錄，從而使MSC對(duì)鐵死亡敏感。作者的研究首次提出了過度鐵死亡是MSCs移植入受損肝臟或ROS刺激后損失的主要原因，以此為靶點(diǎn)實(shí)施有效策略將有利于優(yōu)化基于間充質(zhì)干細(xì)胞的治療。